Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/42571
Title: FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF IMMUNE-RELATED PROTEINS FROM BLACK TIGER SHRIMP Penaeus monodon IN RESPONSE TO PATHOGEN INFECTION
Other Titles: ลักษณะสมบัติเชิงหน้าที่ของโปรตีนในระบบภูมิคุ้มกันจากกุ้งกุลาดำ Penaeus monodon ในการตอบสนองต่อการติดเชื้อก่อโรค
Authors: Phattarunda Jaree
Advisors: Anchalee Tassanakajon
Kunlaya Somboonwiwat
Other author: Chulalongkorn University. Faculty of Science
Advisor's Email: anchalee.k@chula.ac.th
kunlaya.s@chula.ac.th
Subjects: Penaeus monodon
Immunity
Pathogenic bacteria
กุ้งกุลาดำ
ภูมิคุ้มกัน
แบคทีเรียก่อโรค
ปริญญาดุษฎีบัณฑิต
Issue Date: 2013
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: Shrimp immunity comprises of various effector molecules that are expressed and function in response to various stimuli including pathogens. In this research, two immune-related proteins; Anti lipopolysaccharise factor isoform 3 (ALFPm3) and Viral responsive protein 15 (PmVRP15) were characterized. The ALFPm3 has previously been shown to exhibit very active antimicrobial activity against a broad range of Gram-positive and Gram-negative bacteria, fungi and virus. The propose of this research is to study the effects of treating ALFPm3 on membrane of Vibrio harveyi. The recombinant ALFPm3 protein was found to localize on the V. harveyi cells in vivo, followed by inducing membrane permeabilization and leakage of cytoplasmic components. Membrane disruption and damage, bleb and pore formation, and the leakage of cytoplasmic contents were all clearly observed by scanning and transmission electron microscopy. Our results suggested that ALFPm3 effectively kills bacteria through bacterial membrane permeabilization mechanism. Other immune-related protein with unknown function, namely PmVRP15, is of interest among the highly up-regulated gene identified in hemocyte of White spot syndrome virus (WSSV)-infected shrimp. RNAi-mediated silencing of PmVRP15 gene in WSSV-infected shrimp resulted in a significant decreased in the expression of WSSV genes including ie-1 (immediate early stage), wsv477 (early stage) and vp28 (late stage) by 83.5%, 85.5% and 94.8%, respectively. The significant decrease in the cumulative mortality of WSSV-infected shrimp following PmVRP15 knockdown suggested its important role in viral propagation. The interaction between PmVRP15 and WSSV proteins was identified by yeast two-hybrid screening and confirmed by co-immunoprecipitation (Co-IP). WSV399 protein was identified as a PmVRP15 binding protein. Immunobloting analysis (in vitro) and immunoelectron microscopy (in vivo) identified WSV399 as the tegument protein. Moreover, the regulation of PmVRP15 gene expression was studied. About 2 kbp of 5’ flanking promoter sequences of PmVRP15 gene were identified by genome walking technique. Promoter deletion assay identified (-525/-428) and (-287/-209) nucleotide positions as repressor and activator binding sites, respectively. The computational analysis and site directed mutagenesis revealed that the repressor binding site (-525/-428) is regulated by interferon regulatory factor (IRF) and activator binding sites in (-287/-209) region are regulated by octamer transcription factor (Oct-1) and nuclear factor of activated T cells (NFAT).
Other Abstract: ในระบบภูมิคุ้มกันของกุ้งมีโปรตีนหลายชนิดที่มีการแสดงออกและทำหน้าที่ตอบสนองต่อสิ่งกระตุ้นรวมทั้งเชื้อก่อโรคในกุ้ง ในงานวิจัยนี้สนใจศึกษาโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกัน 2 ตัว คือ Anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 (ALFPm3) และ Viral responsive protein 15 (PmVRP15) ที่พบในกุ้งกุลาดำ จากผลงานวิจัยที่ผ่านมาพบว่าโปรตีน ALFPm3 มีความสามารถในการต้านเชื้อแบคทีเรียแกรมลบและแกรมบวก เชื้อรา และไวรัสได้ ในงานวิจัยนี้ สนใจที่จะศึกษาผลของโปรตีน ALFPm3 ต่อเชื้อแบคทีเรียก่อโรคในกุ้ง Vibrio harveyi จากการทดลองพบว่าโปรตีน ALFPm3 สามารถจับกับแบคทีเรีย V. harveyi ส่งผลให้เกิดการรั่วของผนังเซลล์เมมเบรนของแบคทีเรีย ทำให้เกิดการรั่วของสารจากในเซลล์ออกมานอกเซลล์ จากนั้นได้ทำการศึกษาโครงสร้างภายนอกของแบคทีเรีย V. harveyi หลังจากบ่มกับโปรตีน ALFPm3 ด้วยเครื่องจุลทรรศอิเล็กตรอนแบบส่องกราดและแบบส่องผ่าน พบว่าเซลล์เมมเบรนของแบคทีเรียถูกทำลายให้มีลักษณะเปลี่ยนแปลงไป เช่นเกิดการโป่งของเมมเบรน (bleb formation) เมมเบรนเป็นรู (pore formation) และยังมีการรั่วของสารประกอบจากภายในเซลล์ออกมานอกเซลล์ จากผลการทดลองสามารถสรุปได้ว่า โปรตีน ALFPm3 สามารถฆ่าแบคทีเรียก่อโรค V. harveyi โดยการแทรกผ่านเซลล์เมมเบรน และทำให้เกิดการรั่วของเซลล์เมมเบรน ในส่วนของโปรตีน PmVRP15 ที่มีการแสดงออกเพิ่มมากขึ้นหลังจากกุ้งติดเชื้อไวรัสตัวแดงดวงขาว (White spot syndrome virus, WSSV) พบว่าในกุ้งที่ติดเชื้อไวรัสตัวแดงดวงขาวที่ถูกยับยั้งการแสดงออกของยีน PmVRP15 โดยเทคนิค RNA interference มีการแสดงออกของยีนไวรัสตัวแดงดวงขาวในระยะต่างๆได้แก่ ยีน ie-1 ซึ่งแสดงออกในช่วง immediate early stage ยีน wsv477 ซึ่งแสดงออกในช่วง early stage และยีน vp28 ซึ่งแสดงออกในช่วง late stage ลดลง 83.5% 85.5% และ 94.8% ตามลำดับ หลังการติดเชื้อเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม และเมื่อตรวจสอบอัตราการตายของกุ้งพบว่าในกุ้งที่ไม่มียีน PmVRP15 มีอัตราการตายลดลง เมื่อเทียบกับกุ้งกลุ่มควบคุม จึงสามารถสรุปได้ว่า ยีน PmVRP15 มีความสำคัญกับการเพิ่มจำนวนไวรัสในกุ้ง ในการหาโปรตีนของไวรัสที่สามารถจับกับโปรตีน PmVRP15 ด้วยเทคนิค Yeast two-hybrid และ Co-immunoprecipiation พบว่าโปรตีน WSV399 สามารถจับกับโปรตีน PmVRP15 ได้ และเมื่อทำการตรวจสอบหาตำแหน่งของโปรตีน WSV399 บนไวรัสตัวแดงดวงขาวด้วยเทคนิค Immunobloting analysis และ immunoelectron microscopy พบว่าโปรตีน WSV399 เป็นโปรตีนโครงสร้างที่อยู่ในส่วนของ Tegument นอกจากนี้ได้ ศึกษาการควบคุมการแสดงออกของยีน PmVRP15 เริ่มจากการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ของปลาย 5’ ของยีน PmVRP15 ด้วยเทคนิค genome walking ได้ขนาดประมาณ 2 กิโลเบส จากนั้นทำการหาส่วนที่สำคัญที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมการแสดงออกของยีน พบว่า บริเวณลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ตำแหน่ง -525 ถึง -428 และ ตำแหน่ง -287 ถึง -209 น่าจะเป็นบริเวณที่มี repressor และ activator มาจับและควบคุมการแสดงออกของยีนตามลำดับ จากนั้นใช้โปรแกรมคอมพิวเตอร์ และใช้เทคนิค Site-directed mutagenesis ในการตรวจสอบตำแหน่งที่มีผลต่อการแสดงออกของยีน จากผลการทดลองพบว่าบริเวณลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ตำแหน่ง -525 ถึง -428 พบลำดับนิวคลีโอไทด์ที่จำเพาะกับ interferon regulatory factor (IRF) ที่คาดว่าทำหน้าที่เป็น repressor ในการควบคุมการแสดงออกของยีน PmVRP15 และ บริเวณลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ตำแหน่ง -287 ถึง -209 พบลำดับนิวคลีโอไทด์ที่จำเพาะกับ octamer transcription factor (Oct-1) and nuclear factor of activated T cells (NFAT) ที่คาดว่าทำหน้าที่เป็น activator ในการควบคุมการแสดงออกของยีน PmVRP15
Description: Thesis (Ph.D.)--Chulalongkorn University, 2013
Degree Name: Doctor of Philosophy
Degree Level: Doctoral Degree
Degree Discipline: Biochemistry and Molecular Biology
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/42571
URI: http://doi.org/10.14457/CU.the.2013.47
metadata.dc.identifier.DOI: 10.14457/CU.the.2013.47
Type: Thesis
Appears in Collections:Sci - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
5272471323.pdf7.05 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.