Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/56649
Title: การพัฒนาชุดตรวจวิเคราะห์โพรเจสเทอโรนในน้ำนมโคด้วยวิธีเอนไซม์ลิงค์อิมมิวโนซอร์เบนด์แอสเสย์ : รายงานการวิจัย
Other Titles: Development of progesterone assay in bovine milk using enzyme-linked immunosorbent assay technique
Authors: ทรงจันทร์ ภู่ทอง
อุมาพร พิมพิทักษ์
กิตตินันท์ โกมลภิส
อณุมาศ บัวเขียว
พลกฤษ์ แสงวณิช
Email: songchan.p@chula.ac.th
ไม่มีข้อมูล
kittinan.k@chula.ac.th
orgre_klooi@yahoo.com
ไม่มีข้อมูล
Other author: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. สถาบันวิจัยเทคโนโลยีชีวภาพและวิศวกรรมพันธุศาสตร์
Subjects: อุปกรณ์ตรวจจับสารเคมี
โปรเจสเตอโรน -- การวิเคราะห์
เอนไซม์ลิงค์อิมมูโนซอร์เบนท์แอสเส
Chemical detectors
Progesterone -- Analysis
Enzyme-linked immunosorbent assay
Issue Date: 2554
Publisher: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
Abstract: โพรเจสเทอโรนเป็นสเตอรอยด์ฮอร์โมน (C21 steroid, pregn-4-ene-3, 20 dione) ซึ่งถูกผลิตและหลั่งมาอยู่ในน้าเลือดและน้านมโดยคอร์ปัสลูเทียมหลังจากการตกไข่ระหว่างวงรอบการเป็นสัด เป็นที่ทราบกันว่าระดับความเข้มข้นของโพรเจสเทอโรนสามารถใช้ระบุการเข้าสู่วงรอบการเป็นสัดและการตั้งครรภ์ของโคได้โดยมีความถูกต้องอยู่ที่ 75 – 96% ดังนั้นวิธีการตรวจหาทางระบบภูมิคุ้มกันจึงได้รับการพัฒนาและนาไปใช้ในการตรวจหาระดับฮอร์โมนโพรเจสเทอโรน โดยการใช้เทคนิค enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ซึ่งถือว่าเป็น หนึ่งในวิธีการที่เหมาะสมที่สุด เนื่องจากให้ ความไวสูง สามารถทาได้ง่าย และมีความจาเพาะสูง ในการศึกษานี้ได้พัฒนาชุดตรวจแบบ antibody-captured competitive ELISA โดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดี โคลน 5/G7-F4 ที่ถูกสร้างมาจากการใช้โพรเจสเทอโรน 3-(o-carboxymethyl) oxime (P3-CMO) ในการกระตุ้น มาตรวจโพรเจสเทอโรนในรูป P3-CMO และ P4 (pregn-4-ene-3, 20 dione) จากการทดลองพบว่าความไวของการตรวจในรูปค่าความเข้มข้นในการยับยั้งที่ 50% ( IC50) และค่าขีดจากัดในการตรวจวัด (LOD) สาหรับโพรเจสเทอโรน P3-CMO มีค่า 2.18 และ 0.12 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร ตามลาดับ ในขณะที่การตรวจโพรเจสเทอโรน P4 มีค่าเท่ากับ 4.85 และ 0.5 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร ตามลาดับ ผลที่ได้นี้ ชี้ให้เห็นว่า ELISA ที่พัฒนาขึ้นมีความไวสูงพอที่จะใช้ตรวจโพรเจสเทอโรนในระหว่างรอบการเป็นสัดและการตั้งครรภ์ ( มีค่าโดยประมาณระหว่าง 1 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร และ 25 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร) ต่อมาจึงได้นา ELISA ที่พัฒนาขึ้นไปตรวจโพรเจสเทอโรน (P3-CMO) ที่ถูกเติมลงใน skim milk โดยค่าความถูกต้องของการตรวจจะแสดงในรูปของค่าร้อยละของการนากลับ (%recovery) และค่าความแม่นยาของการตรวจจะแสดงในรูปของร้อยละของสัมประสิทธิ์ของความแปรปรวน ( %coefficient of variation, % CV) ซึ่งพบว่ามีค่า 85-103 % และ 0.01-0.18 % ตามลาดับ จากการหาค่า %CV ของการวิเคราะห์ในการทดลองเดียวกัน (intra-variation assay) และระหว่างการทดลอง (inter-variation assay) พบว่ามีค่าอยู่ในช่วง 0.04-1 % และ 0.01-0.18 % ตามลาดับ เมื่อนา ELISA ที่พัฒนาขึ้นมาตรวจโพรเจสเทอโรนในรูป P4 ในส่วนไขมันหลัก (core fat) ที่สกัดจากน้านมดิบพบว่ามีค่าค่าร้อยละของการนากลับและร้อยละของสัมประสิทธิ์ของความแปรปรวนอยู่ในช่วง 80%-118% และ 0.03%-3.33% ตามลาดับ โดยปริมาณโพรเจสเทอโรนที่ตรวจควรมีค่าอยู่ในช่วง 1-100 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร จากนั้นได้ใช้ ELISA ที่พัฒนาขึ้นตรวจปริมาณโพรเจสเทอโรนในน้านมโคดิบจากพระราชวังสวนจิตรลดา พบว่า สามารถตรวจสอบปริมาณโพรเจสเทอโรนที่อยู่ใน core fat และ skim milk ได้ แต่ปริมาณที่ตรวจได้จะให้ค่าสูงกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับการตรวจด้วยชุดตรวจสอบทางการค้า อย่างไรก็ตามชุดตรวจที่พัฒนาขึ้นสามารถใช้บอกระดับการเพิ่มขึ้นหรือลดลงของโพรเจสเทอโรนในแต่ละวันได้สอดคล้องกับชุดตรวจสอบทางการค้า จากผลการทดลองชี้ให้เห็นว่า ELISA ที่พัฒนาขึ้นสามารถนามาใช้ในการตรวจสอบฮอร์โมนโพรเจสเทอโรนในนมดิบได้โดยมีความถูกต้องและแม่นยาอยู่ในช่วงที่ยอมรับได้
Other Abstract: Progesterone is a steroid hormone (C21 steroid, pregn-4-ene-3, 20 dione) which is produced and released into plasma and milk by corpus luteum after ovulation during estrous cycle. It has been known that the concentration level of progesterone can be used to identify cow heat period and pregnancy at 75 - 96% accuracy. Therefore, immunological method has been developed and applied for progesterone detection. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is considered to be one of the most suitable methods due to its high sensitivity, simplicity and specificity. In this study, an antibody-captured competitive ELISA was developed using the monoclonal antibody clone 5/G7-F4 which was raised against progesterone 3-(o-carboxymethyl) oxime (P3-CMO) to detect progesterone P3-CMO and P4 (pregn-4-ene-3, 20 dione). The sensitivity in terms of the 50% inhibition concentration (IC50) and the limit of detection (LOD) for P3-CMO were found at 2.18 and 0.12 ng/ml, respectively. While those for P4 were found at 4.85 and 0.5 ng/ml, respectively. These results indicated that the developed ELISA was sensitive enough to detect progesterone during the estrous cycle and pregnancy period (approximately ranged between 1 ng/ml and 25 ng/ml). Later, the developed ELISA was applied to detect progesterone in fortified skim milk samples. The accuracy of the test was quantified in term of %recovery and the precision was quantified in term of %coefficients of variation (%CV) which were found at 85- 103 % and 0.01-0.18 %, respectively. Moreover, the %CV of both intra-assay and inter-assay was also quantified and found in the range of 0.04-1% and 0.01-0.18%, respectively. The developed ELISA was used to detect progesterone P4 in core fat extract from whole milk in which the %recovery and the %CV was found in the range of 80-118% and 0.03-3.33%, respectively. The concentration of progesterone should be in the range of 1-100 ng/ml. The developed was applied to detect progesterone in whole milk samples collected from cows at the Chitarada Royal Palace. The result showed that it could quantify the concentration of progesterone in both core fat and skim milk. But the concentrations detected were comparatively higher than those found by a commercially available ELISA test kit. However, the developed ELISA could identify the increase or decrease level of progesterone during the test period as compared to the commercial test kit. These results suggested that the developed ELISA could be used to detect progesterone in whole milk with an acceptable range of accuracy and precision.
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/56649
Type: Technical Report
Appears in Collections:Biotec - Research Reports

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Songchan_pu_016188.pdf1.37 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.