Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/58939
Title: Cloning and expression of phenylalanine dehydrogenase gene from Bacillus lentus
Other Titles: การโคลนและการแสดงออกของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก Bacillus Lentus
Authors: Mayura Thongchuang
Advisors: Kanoktip Packdibamrung
Other author: Chulalongkorn University. Faculty of Science
Advisor's Email: Kanoktip.P@chula.ac.th
Subjects: Genes
Cloning
Gene expression
Amino acid sequence
ยีน
โคลนิง
ลำดับกรดอะมิโน
Issue Date: 2006
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: NAD⁺-dependent phenylalanine dehydrogenase (EC 1.4.1.20) catalyzes the reversible oxidative deamination of L-phenylalanine to form ammonia, phenylpyruvate and NADH. Our research group has studied phenylalanine dehydrogenase from Bacillus lentus and found that the enzyme had high substrate specificity in the oxidative deamination on L-phenylalanine and the reductive amination on phenylpyruvate. No loss of the enzyme activity was observed upon incubation at 50° for 4 hours. The enzyme retained 50% of the activity after incubation at the same temperature for 3 days. Therefore, in this research, the amino acid sequence of 3 internal peptide fragments of phenylalanine dehydrogenase were determined and used for degenerated primer design. The nucleotide sequencing of phenylalanine dehydrogenase gene (phedh) was investigated by inverse PCR and then the whole gene was cloned and expressed in E. coli BL2 (DE3) using expression vector, pET-17b. The specific activity of crude recombinant enzyme was 92.0 fold higher than that of the enzyme from B. lentus. The optimum condition for phedh gene expression was induction with 0.2 mM IPTG for 8 hours. In spite of daily subculture for 50 days, the phedh gene expression in E. coli BL21(DE3) remained 57.7% of that of the parent. Recombinant enzyme was purified 2.11 fold with a 31.0% yield by procedure involving 40-50% ammonium sulfate precipitation, DEAE-Toyopearl and Butyl-Toyopearl column chromatography. The enzyme had a molecular mass about 340 kDa and consisted of 8 identical subunits. The optimum pHs for the oxidative deamination and the reductive amination were 10.7 and 7.8 respectively and optimum temperatures were 45[degrees Celsius] and 50[degrees Celsius], respectively. The enzyme was stable over a broad pH range from 7.0 to 11.0 The apparent K[subscriptm] values for L-phenylalanine, NAD⁺, phenylpyruvate, NH₄CI and NADH were 0.45, 0.40, 0.15, 48 and 0.15 mM, respectively.
Other Abstract: ฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนส (EC 1.4.1.20) เร่งปฏิกิริยาการดึงหมู่อะมิโนจากแอล-ฟีนิลอะลานีนให้ผลิตภัณฑ์เป็นฟีนิลไพรูเวทและแอมโมเนีย ซึ่งเป็นปฏิกิริยาที่ผันกลับได้และใช้ไพริดีนนิวคลีโอไทด์เป็นโคเอนไซม์กลุ่มวิจัยของเราได้ศึกษาฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก Bacillus lentus และพบว่าเอนไซม์มีความจำเพาะสูงต่อแอล-พีนิลอะลานีนซึ่งเป็นซับเสเตรตในปฏิกิริยา oxidative deamination และฟีนิลไพรูเวทซึ่งเป็นซับสเตรตในปฏิกิริยา reductive amination นอกจากนั้นยังมีความเสถียรต่ออุณหภูมิสูงโดยไม่สูญเสียแอคติวีตีเมื่อบ่มเอนไซม์ที่ 50 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 4 ชั่วโมงและเอนไซม์ยังคงมีแอคติวิตีเหลืออยู่ 50 เปอร์เซ็นต์เมื่อบ่มที่อุณหภูมิเดียวกันนี้เป็นเวลา 3 วัน ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงนำลำดับกรดอะมิโนบางส่วนภายในสายเอนไซม์จำนวน 3 สายมาใช้เป็นข้อมูลในการออกแบบไพรเมอร์เพื่อเพิ่มชิ้นยีนส่วนในของฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสด้วยเทคนิคพีซีอาร์ และหาลำดับนิวคลีโอไทด์ของชิ้นยีนทั้งชิ้นด้วยเทคนิค inverse PCR จากนั้นโคลนยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก B. lentus เข้าสู่ E. coli BL21(DE3) โดยใช้ expression vector (pET-17b) เมื่อวิเคราะห์สารละลายของเอนไซม์หยาบที่ได้จากรีคอมบีแนนท์โคลนพบว่ามีแอคติวิตีจำเพาะสูงกว่าเอนไซม์จาก B. lentus 92.0 เท่า ภาวะที่เหมาะสมในการหเหนี่ยวนำ ให้เกิดการแสดงออกของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโรจิเนสคือ การเหนี่ยวนำด้วย IPTG 0.2 มิลลิโมลาร์เป็นเวลา 8 ชั่วโมง การทดสอบความเสถียรของการแสดงออกของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนส โดยการเพาะเชื้อต่อช่วงรีคอมบิแนนท์โคลน 50 ครั้ง พบว่า การแสดงออกของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสยังคงเหลือถึง 57.7 เปอร์เซ็นต์ของเชื้อเริ่มต้น เมื่อทำเอนไซม์ให้บริสุทธิ์ด้วยการตกตะกอนด้วยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟต คอลัมน์ดีอีเออีโทโยเพิร์ล และคอลัมน์บิวทิลโทโยเพิร์ล พบว่าเอนไซม์มีแอคติวิตีคงเหลือ 31.0 เปอร์เซ็นต์และมีความบริสุทธิ์ขึ้น 2.11 เท่า เอนไซม์มีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 340,000 ดาลตันประกอบด้วย 8 หน่วยย่อยที่มีน้ำหนักโมเลกุลเท่ากัน pH ที่เหมาะสมในการเร่งปฏิกิริยา oxidative deamination และ reductive amination คือ 10.7 และ 7.8 ตามลำดับ และอุณหภูมิที่เหมาะสมในการเร่งปฏิกิริยาคือ 45 และ 50 องศาเซลเซียส เอนซ์มีความเสถียรต่อ pH ในช่วง 7.0 ถึง 11.0 เอนไซม์มีค่า K[subscript m] ต่อแอล-ฟีนิลอะลานีน NAD⁺ฟีนิลไพรูเวท แอมโมเนีย และ NADH เท่ากับ 0.45, 0.40, 0.15, 48 และ 0.15 มิลลิโมลาร์ ตามลำดับ
Description: Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 2006
Degree Name: Master of Science
Degree Level: Master's Degree
Degree Discipline: Biotechnology
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/58939
Type: Thesis
Appears in Collections:Sci - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
mayura_th_front.pdf2.11 MBAdobe PDFView/Open
mayura_th_ch1.pdf4.42 MBAdobe PDFView/Open
mayura_th_ch2.pdf3.81 MBAdobe PDFView/Open
mayura_th_ch3.pdf8.2 MBAdobe PDFView/Open
mayura_th_ch4.pdf2.17 MBAdobe PDFView/Open
mayura_th_ch5.pdf386.9 kBAdobe PDFView/Open
mayura_th_back.pdf5.11 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.