Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/59253
Title: Acetylcholinesterase inhibitory activity of proteins from the rhizomes of zingiberaceae plants
Other Titles: โปรตีนที่มีฤทธิ์ยับยั้งอะเซทิลโคลีนเอสเทอเรสจากเหง้าของพืชวงศ์ขิง
Authors: Porlin Rungsaeng
Advisors: Aphichart Karnchanatat
Polkit Sangvanich
Other author: Chulalongkorn University. Faculty of Science
Advisor's Email: Aphichart.K@Chula.ac.th
Polkit.S@Chula.ac.th
Issue Date: 2010
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: Acetylcholinesterase inhibitors (AChEIs) have been used as drugs for the symptomatic treatment of Alzheimer’s disease (AD). In order to search for new AChEIs, 15 Zingiberaceae plants were tested for AChEI activity in rhizome extracts. The crude homogenate and ammonium sulphate cut fraction of Zingiber officinale contained a significant AChEI activity. Eighty % saturation (NH4)2SO4 precipitation and DEAE-cellulose ion-exchange chromatography (unbound fraction) enriched the protein to a single band on non-denaturing and reducing SDS-PAGE (ca 33.5 kDa), but in-gel-tryptic digestion with LC-MS/MS resolution revealed two heterogenous peptides, a 16 amino acid fragment with 100% similarity to Zingipain-1, a cysteine protease from Zingiber officinale, suggesting the preparation was heterogeneous. Gelatin-degrading zymography showed that the AChEI containing band also contained protease activity. The AChEI activity was largely stable between -20 – 60 °C (at least over 120 mins), and over a broad pH range (2 - 12). The AChEI activity was stimulated strongly by Mn2+ and Cu2+ at 1 - 10 mM, and weakly by Ca2+, Fe2+, Mg2+ and Zn2+ at 1 – 5 mM but inhibited at 10 mM. In contrast, Hg2+ and EDTA were very and moderately strongly inhibitory. AChEI exhibited non-competitive inhibition of AChE for the hydrolysis of acetylthiocholine iodide with a Ki value of 9.31 mg/ml, a Vmax of 3.41 mM/min and a Km of 130.6 mM.
Other Abstract: สารที่มีฤทธิ์ยับยั้งอะเซทิลโคลีนเอสเทอเรสมักถูกใช้เป็นยาที่ใช้ในการรักษาอาการของผู้ป่วยโรคอัลไซเมอร์ งานวิจัยนี้มีความสนใจนำเหง้าของพืชวงศ์ขิง 15 ชนิดมาทำการศึกษาหาโปรตีนที่มีกิจกรรมการยับยั้บอะเซทิลโคลีนเอสเทอเรส ส่วนสกัดหยาบและส่วนโปรตีนหยาบที่ทำการตกตะกอนด้วยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตพบว่าขิงมีกิจกรรมการยับยั้งการทำงานของอะเซทิลโคลีเอส-เทอเรสดีที่สุด ซึ่งจากการตกตะกอนด้วยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวที่ 80 เปอร์เซ็นต์ และทำให้บริสุทธ์โดยโครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนประจุที่มีดีอีเออี เซลลูโลสเป็นตัวค้ำจุน พบว่าส่วนของโปรตีนที่ไม่ติดกับคอลัมน์ มีกิจกรรมการยับยั้งการทำงานของอะเซทิลโคลีนเอสเทอเรสที่ดีเมื่อใช้เทคนิคพอลิอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรฟอเรซิสแบบไม่เสียสภาพและเสียสภาพ พบว่าโปรตีนที่ไม่ติดกับคอลัมน์ มีโปรตีนบริสุทธิ์อย่างน้อย 1 ชนิดที่มีขนาด 33.5 กิโลดาลตัน เมื่อวิเคราะห์ลำดับกรดอะ- มิโนภายในโมเลกุลโดยการตัดด้วยทริปซิน แล้ววิเคราะห์ชิ้นส่วนที่ถูกย่อยด้วยเครื่อง LC-MS/MS พบเพปไทด์ 2 สายที่มี 16 กรดอะมิโนที่มีความคล้าย 100 เปอร์เซ็นต์กับซินจิเพน-หนึ่ง (ซิเตอีน โปร- ติเอสจาก ขิง) จากการทำไซโมกราฟฟี พบว่าแถบที่มีกิจกรรมการยับยั้งอะเซทิลโคลีนเอสเทอเรสนั้นมีกิจกรรมของโปรติเอสด้วย สารยับยั้งอะเซทิลโคลีนเอสเทอเรสมีเสถียรภาพที่อุณหภูมิ -20 จนถึง 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลานาน 120 นาทีและที่ค่าความเป็นกรด-ด่างเท่ากับ 2 จนถึง 12 นอกจากนั้นสารยับยั้งอะเซทิลโคลีนเอสเทอเรสยังสามารถถูกกระตุ้นได้ด้วย Mn2+ และ Cu2+ ที่ 1 - 10 มิลลิโมล ถูกทำให้มีกิจกรรมการยับยั้งอะเซทิลโคลีนเอสเทอเรสลดลงในระดับกลางได้ด้วย Ca2+, Fe2+, Mg2+ และ Zn2+ ที่ 1-5 มิลลิโมล และถูกยับยั้งกิจกรรมการยับยั้งอะเซทิลโคลีนเอสเทอเรสที่ 10 มิลลิโมล นอกจากนั้น Hg2+ และ EDTA จะยับยั้งกิจกรรมการยับยั้งกิจกรรมอะเซทิลโคลีนเอสเทอเรส สำหรับการวิเคราะห์จลนพลศาสตร์ของกิจกรรมยับยั้งอะเซทิลโคลีนเอสเทอเรสพบว่ามีการยับยั้งแบบไม่แข่งขันชนิด Non-competivive ที่มีค่า Ki เท่ากับ 9.31 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร Vmax เท่ากับ 3.41 มิลลิโมลต่อนาที และ Km เท่ากับ 130.6 มิลลิโมล
Description: Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 2010
Degree Name: Master of Science
Degree Level: Master's Degree
Degree Discipline: Biotechnology
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/59253
Type: Thesis
Appears in Collections:Sci - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Porlin Rungsaeng.pdf945.91 kBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.