Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/59255
Title: Angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity of purified proteins and peptides from the rhizomes of zingiberaceae plants
Other Titles: ฤทธิ์ยับยั้งแอนจิโอเทนซินI-คอนเวอร์ติงเอนไซม์ของโปรตีนและเพปไทด์ที่บริสุทธิ์จากเหง้าของพืชวงศ์ขิง
Authors: Maneerat Yodjun
Advisors: Polkit Sangvanich
Aphichart Karnchanatat
Other author: Chulalongkorn University. Faculty of Science
Advisor's Email: Polkit.S@Chula.ac.th
Aphichart.K@Chula.ac.th
Subjects: Angiotensin I-converting enzyme
ขิง
Issue Date: 2010
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: Angiotensin I- converting enzyme (ACE) plays a major role in the regulation of blood pressure by virtue of two different reactions that it catalyzes: conversion of the inactive decapeptide angiotensin I to a powerful vasoconstrictor and salt-retaining octapeptide angiotensin II, and inactivation of the vasodilator and natriuretic nonapeptide, bradykinin. Blood pressure-lowering activities of pure protein and pepsin hydrolysates of protein of Zingiberaceae plants were assayed in vitro by inhibition of the angiotensin I-converting enzyme. The crude protein of 15 plants in Zingiberaceae family were screened for their ACE inhibitory by in vitro ACE inhibitory activity protein was isolated from Zingiberaceae plants. Crude protein of Z. ottensi. rhizome was high activity, having IC50 of 7.30×10-7 mg protein/ml. Rhizomes proteins were isolated and then purified by stepwise eluted SP sepharose chromatography. Five unbound fractions obtained from purification step were called F25, F50, F75, and F100. The highest protein content was found in the F75 fraction. Results form native and reducing SDS-PAGE indicated that the F75 was single protein gave an estimated size of about 20.7 kDa. The tryptic fragments of the ACEI were sequenced using LC-MS/MS analysis, it resulted suggested that its amino acid sequence is similar to chitinase. The effect ACEI activity of F75 was largely stable at temperature between -20 and 60 °C (at a 30 min exposure). The pH inhibition effect of fraction F75 was negated at pH 6 and steeply reduced at pH 8 – 12. This protein exhibited a strong ACE inhibitory activity which Ki was of 9.1 × 10-5 mg protein/ml. For the analysis of peptides from Z. cassumunar which derived from pepsin hydrolysates at 37oC for 30 min possessed ACE inhibition at IC50 of 0.38±0.012 mg/ml, after fractionation by RP-HPLC was ascribed to a single peptide with IC50 for ACE inhibitory at 0.011±0.012 mg/ml. The peptide was a potent competitive inhibitor of ACE with a Ki of 1.25 × 10-6 mg protein/ml. The sequence of the peptide from Z. cassumunar was found to be Pro-Ala-Glu-Gly-His-Ser, which is similar to the mitochondrial protein sequence from Solanum tuberosum L.
Other Abstract: แอนจิโอเทนซินI-คอนเวอร์ติง เอนไซม์ มีความสำคัญเกี่ยวข้องข้องกับภาวะความดันโลหิตสูงซึ่งมีฤทธิ์ทำให้เกิดการเปลี่ยน แอนจิโอเทนซิน I ไปเป็นแอนจิโอเทนซิน II ซึ่งมีผลต่อการลดความดันโลหิตได้ ในงานวิจัยนี้โปรตีนของพืชวงศ์ขิงที่บริสุทธิ์และโปรตีนที่ถูกย่อยด้วยเปปซิน และนำมาตรวจสอบฤทธิ์การยับยั้งแอนจิโอเทนซินI-คอนเวอร์ติง เอนไซม์ โปรตีนสกัดหยาบจากเหง้าของพืชวงศ์ขิง 15 ชนิด นำมาตรวจสอบฤทธิ์การยับยั้งของแอนจิโอเทนซินI-คอนเวอร์ติงเอนไซม์ โดยการหาฤทธิ์การยับยั้งของโปรตีนซึ่งเป็นการศึกษาในขั้นหลอดทดลอง โปรตีนสกัดหยาบจากเหง้าของไพลดำมีฤทธิ์การยับยั้งของแอนจิโอเทนซินI-คอนเวอร์ติงเอนไซม์สูงสุดมีค่าเท่ากับ7.30×10-7 มิลลิกรัมโปรตีนต่อมิลลิลิตรจากนั้นนำโปรตีนมาทำให้บริสุทธิ์โดยเทคนิคโครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนไอออนด้วยคอลัมน์ SP sepharose โดยชะแบบเป็นลำดับขั้น สามารถแยกโปรตีนสกัดหยาบได้เป็น 5 ส่วน คือ unbound F25 F50 F75 และ F100 ตามลำดับ โดยส่วน F75 มีปริมาณโปรตีนสูงที่สุด เมื่อใช้เทคนิคพอลิอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรฟอเรซิสแบบเสียสภาพ พบว่าส่วนของ F75 มีโปรตีนบริสุทธิ์อย่างน้อย 1 ชนิดที่มีขนาด 20.7 กิโลดาลตัน เมื่อวิเคราะห์ลำดับกรดอะมิโนภายในโมเลกุลโดยการตัดด้วยทริปซิน แล้ววิเคราะห์ชิ้นส่วนที่ถูกย่อยด้วยเครื่อง LC-MS/MS พบว่าลำดับอะมิโนของไพลดำมีความคล้ายคลึงกับกลุ่มไคติเนส ทำการศึกษาฤทธิ์ของสารยับยั้งแอนจิโอเทนซินI-คอนเวอร์ติงเอนไซม์ของ F75 มีเสถียรภาพที่อุณหภูมิ -20 จนถึง 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 นาทีและที่ค่าความเป็นกรด-ด่าง ซึ่งมีค่าลดลงในช่วงพีเอช 6 และเพิ่มขึ้นสูงช่วง 8-12 และนำโปรตีนมาศึกษาทางจลนพลศาสตร์พบว่ามีค่า Ki เท่ากับ 9.1 × 10-5 มิลลิกรัมโปรตีนต่อมิลลิลิตร ในส่วนของเพปไทด์พบว่าโปรตีนจากเหง้าของไพลเหลืองที่ทำการย่อยด้วยเปปซินที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 นาที สามารถหาฤทธิ์ของสารยับยั้งเอนไซม์แอนจิโอเทนซินI-คอนเวอร์ติงเอนไซม์ ได้ค่า IC50 เท่ากับ 0.38±0.012 มิลลิกรัมโปรตีนต่อมิลลิลิตร หลังจากนั้นนำโปรตีนจากเหง้าของไพลเหลืองที่ทำการย่อยด้วยเปปซินมาแยกเพปไทด์โดย เครื่องเอชพีแอลซีแบบ รีเวอร์เฟส พบว่าได้เพปไทด์มีลักษณะเป็นพีคเดียว และนำมาตรวจสอบฤทธิ์ของสารยับยั้งแอนจิโอเทนซินI-คอนเวอร์ติงเอนไซม์ ได้ค่า IC50 เท่ากับ 0.011±0.012 มิลลิกรัมโปรตีนต่อมิลลิลิตร เมื่อศึกษาทางจลศาสตร์พบว่าเพปไทด์มีค่า Ki เท่ากับ 1.25 × 10-6 มิลลิกรัมโปรตีนต่อมิลลิลิตรและเพปไทด์ของสารยับยั้งแอนจิโอเทนซินI-คอนเวอร์ติงเอนไซม์ มีการยับยั้งแบบแข่งขัน โดยลำดับกรดอะมิโนของเพปไทด์ไพลเหลืองที่พบคือ โปรลีน-อะลานีน-กลูตามิก-ไกลซีน-ฮิสติดีน-เซอรีน ซึ่งมีความคล้ายคลึงกับลำดับกรดอะมิโนของโปรตีนไมโทคอนเดรียจากมันฝรั่ง
Description: Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 2010
Degree Name: Master of Science
Degree Level: Master's Degree
Degree Discipline: Biotechnology
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/59255
Type: Thesis
Appears in Collections:Sci - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Maneerat Yodjun.pdf503.5 kBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.