Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/59353
Title: การใช้เทคนิคด้านพันธุศาสตร์โมเลกุลเพื่อผลิตเปปไทด์ต้านอนุมูลอิสระ และต้านการแบ่งตัวของเซลล์จากเมล็ดผลไม้ไทยใน Pichia pastoris GS115 : รายงานการวิจัยฉบับสมบูรณ์
Other Titles: Application of molecular genetic techniques to produce antioxidative and antiproliferative peptides from Thai fruit seeds in Pichia pstoris GS115
Authors: ฤทัยรัตน์ บุญสมบัติ
Email: Ruethairat.B@Chula.ac.th
Other author: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. สถาบันวิจัยเทคโนโลยีชีวภาพและวิศวกรรมพันธุศาสตร์
Subjects: อนุมูลอิสระ
แอนติออกซิแดนท์
รีคอมบิแนนต์โปรตีน
พิเชียพาสทอริส
Free radicals (Chemistry)
Antioxidants
Recombinant proteins
Pichia pastoris
Issue Date: 2558
Publisher: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
Abstract: เปปไทด์ที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพจากแหล่งธรรมชาติได้รับความนิยมอย่างมากในปัจจุบัน เมล็ดผลไม้เป็น แหล่งสะสมอาหารซึ่งมีความเป็นไปสูงในการพบเปปไทด์ที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพ โดยงานวิจัยนี้ได้คัดเลือก เปปไทด์ที่มีฤท ธิ์ในก า รต้า นอ นุมูล อิสระจา ก เมล็ดลำ ไย โ ดยตั้งชื่อว่า Longan 1 (ISYVVPVYIAEITPKTFRGGF) ทั้งนี้การสกัดจากธรรมชาติโดยตรงยังพบปัญหา เช่น การควบคุม ส่วนผสมของเปปไทด์ในโปรตีนไฮโดรไลเสต งานวิจัยนี้จึงเลือกเทคนิคด้านพันธุศาสตร์โมเลกุลมาใช้ แก้ปัญหา โดยออกแบบชิ้นส่วนดีเอ็นเอให้ประกอบด้วยออกแบบนิวคลีโอไทด์ที่แปลรหัสแล้วได้เป็น ลำดับกรดอะมิโอของเปปไทด์ Logan 1 เรียงต่อกัน 4 ชุด แต่ละชุดคั่นด้วยโคดอนกรดอะมิโนแอสพาร์ ติก เพื่อให้ชิ้นส่วนดีเอ็นเอยาวเพียงพอสำหรับการจัดการด้วยเทคนิคด้านพันธุศาสตร์โมเลกุล จากนั้น ตัดต่อเข้าเวคเตอร์พาหะ pPICZαA และนำเข้าสู่โครโมโซมของ P. pasotoris GS115 เมื่อเหนี่ยวนำให้ เกิดการแสดงออก พบโปรตีนที่คาดว่าเป็นรีคอมบิแนนท์เปปไทด์เป้าหมายขนาดประมาณ 10 และ 20 กิโลดาลตัน อย่างไรก็ตามเมื่อตรวจสอบด้วยเทคนิคแมสสเปกโตรเมตรี แล้วพบว่าไม่ใช่รีคอมบิแนนท์ เปปไทด์ที่ต้องการ นอกจากนี้การใช้ P. pasotoris ในการแสดงออกพบปัญหาหลายประการ จึงได้ทำ การแก้ปัญหาโดยเปลี่ยนระบบการแสดงออกเป็น Escherichia coli โดยนำชิ้นส่วนดีเอ็นเอชิ้นเดียวกัน ใส่เข้าพลาสมิด pQE-30 Xa และนำเข้าสู่ E. coli MG1655 โดยเมื่อเหนี่ยวนำให้เกิดการแสดงออกพบ แถบโปรตีนขนาดประมาณ 13 กิโลดาลตันในส่วนโปรตีนละลายน้ำ ซึ่งเป็นรีคอมบิแนนท์เปปไทด์ที่ ต้องการเมื่อทำให้บริสุทธิ์ผ่านคอลัมน์และตรวจสอบด้วยวิธี Western Blot นอกจากนี้ยังพบการต้าน ออกซิเดชั่นเมื่อตรวจสอบด้วยวิธีต่างๆ โดยเฉพาะไนตริกออกไซด์เมื่อเทียบกับข้อมูลของโปรตีน ไฮโดรไลเสต และยังพบว่ารีคอมบิแนนท์เปปไทด์ Longan 1 มีฤทธิ์ในการต้านการแบ่งตัวของ เซลล์มะเร็งกระเพาะ (KATO-III)
Other Abstract: Bioactive peptides from natural sources are currently favorable. Fruit seeds are sources of accumulated food, so there are potential sources for discovering bioactive peptides. In this research, an antioxidative peptides from longan seeds, named as Longan 1 (ISYVVPVYIAEITPKTFRGGF) was selected. However, direct extraction of the peptides from natural sources encounters some problems such as controlling of pepitide composition in protein hydrolysate. To overcome these problems, molecular genetic technique is chosen in this research by designing DNA fragment containing 4 repeats of the Longan 1 peptide linked by the codons of Aspartic acid in order to obtain adequetly long peptides for being manipulated by molecular genetic teqnique. Then, the DNA fragment wasinserted into the expression vector, pPICZαA and further integrated onto P. pastoris GS115 chromosome. After induction, the expected 10 and 20 kDa protein bands were revealed. However, they were not target peptide after being verified by mass spectrometry. Furthermore, there were several problems when using P. pastoris as expression host. Therefore, to solve these problems, the expression system was changed to Escherichia coli. The same DNA fragment was inserted into the plasmid pQE-30 Xa, and then transformed into E. coli MG1655. After induction, the expected 13 kDa protein band was found as in soluble protein fraction. It was found as recombinant target protein after being purified by affinity column and verified by Westrn blot. Moreover, the recombinant peptide was able to scavange free radicals, when characterized by several methods, especially nitric oxide when compared to the data of protein hydrolysate. The recombinant Longan 1 peptide was also revealed antiprolifative activity against stomach cancer, KATO-III.
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/59353
Type: Technical Report
Appears in Collections:Biotec - Research Reports

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Ruethairat Bo_Res_2558.pdf1.21 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.