Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/60330
Title: การพัฒนาชุดตรวจด้วยวิธีเอนไซม์ลิงค์อิมมูโนซอร์เบนท์เอสเสย์ ของอนุพันธ์ของสารไนโตรฟูแรน:3-อิมิโน-2-ออกซาโซลิดิโนน และ 3-อะมิโน-5-มอร์ฟอลิโนเมทิล-2-ออกซาโซลิดิโนน
Other Titles: Development of enzyme-linked immunosorbent assay test kits for nitrofuran derivatives: 3-AMINO-2-OXAZOLIDINONE and 3-AMINO-5-Morpholinomethyl-2-oxazolidinone
Authors: กิตตินันท์ โกมลภิส
นันทิกา คงเจริญพร
ทรงจันทร์ ภู่ทอง
อุมาพร พิมพิทักษ์
Email: Kittinan.K@Chula.ac.th
Nanthika.K@Chula.ac.th
Songchan.P@Chula.ac.th
Umaporn.P@Chula.ac.th
Other author: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. สถาบันเทคโนโลยีชีวภาพและวิศวกรรมพันธุศาสตร์
Subjects: ไนโตรฟูแรน
อุปกรณ์ตรวจจับสารเคมี
Nitrofurans
Chemical detectors
Issue Date: 2553
Publisher: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
Abstract: 3-อะมิโน-2-ออกซาโซลิดิโนน (AOZ) และ3-อะมิโน-5-มอร์ฟอลิโนเมทิล-2-ออกซาโซลิดิโนน (AMOZ) เป็นสารเมแทบอไลต์ของฟูราโซลิโดนและฟูรัลทาโดนตามลำดับ ซึ่งเป็นยาปฏิชีวนะที่อยู่ในกลุ่มสารไนโตรฟูแรน ใช้สำหรับป้องกันและรักษาโรคติดเชื้อในสัตว์ อย่างไรก็ตามสารเมแทบอไลต์ทั้งสองถูกจัดว่าเป็นสารก่อมะเร็งและทำให้เกิดการกลายพันธุ์ ซึ่งจะเป็นอันตรายต่อผู้บริโภคได้ ทำให้ต้องกมีการตรวจการตกค้างของสารทั้งสองชนิดในผลิตภัณฑ์เนื้อสัตว์ ต่าง ๆ ซึ่งการตรวจสอบด้วยวิธีเอนไซม์ลิงค์อิมมูโนซอร์เบนท์เอสเสย์เป็นวิธีที่เหมาะแก่การตรวจคัดกรองตัวอย่างจำนวนมาก ดังนั้นจุดประสงค์ของงานวิจัยนี้คือการผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่จำเพาะต่อ AOZ และ AMOZ และนำแอนติบอดีที่เหมาะสมไปพัฒนาเป็นชุดตรวจ ELISA โดยได้ทำการกระตุ้นหนูทดลองเพื่อให้สร้างแอนติบอดีต่อสารทั้งสองพบว่า หนูทดลองสามารถสร้างแอนติบอดีที่สามารถจับกับสารในรูปอิสระได้จึงได้ทำการหลอมรวมเซลล์เพื่อเตรียมเซลล์ไฮบริโดมา ในกรณีของ AMOZ ได้ทำการหลอมรวมเซลล์ทั้งหมดจำนวน 5 ครั้งได้โมโนโคลนอลแอนติบอดีจำนวน 21 โคลน จากการศึกษาลักษณะสมบัติขอโมโนโคลนที่คัดเลือกมา 5 โคลน พบว่าไอโซไทป์ของโมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 1F22 E5.1 5A7 และ 7H8 เป็น IgG2b และโคลน 4F1 เป็น IgG2a โดยโคลนที่มีความไวสูงสุดคือ 2E5.1 ซึ่งให้ค่า IC50 และ LOD ต่อสารอิสระ AMOZ เท่ากับ 14.98 ppb และ 1.42 ppb ตามลำดับ ซึ่งโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่ได้มีความจำเพาะต่อสารอิสระ (CPAMOZ NPAMOZ AMOZ และ FTD และไม่พบการเกิดปฏิกิริยา ข้ามกับสารไนโตรฟูแรนตัวอื่น ๆ และยาปฏิชีวนะตัวอื่น ๆ ที่ใช้ทดสอบ เมื่อนำแอนติบอดีไปเตรียมชุดตรวจ ELISA ในรูปแบบต่าง ๆ พบว่า รูปแบบของ Antibody captured indirect competitive ELISA (Streptavidin-HRP) ให้ค่า LOD(0.06 ppb) ต่ำที่สุดและต่ำกว่าค่า MRPL (0.3 ppb) จึงเลือกรูปแบบนี้มาทำการประเมินประสิทธิภาพโดยใช้ตัวอย่างเนื้อกุ้งที่เติมสาร AMOZ ลงไปพบว่าสำหรับ intra-variation assay จะได้ค่า %CV อยู่ในช่วง 16.1-0.03% และ %recovery อยู่ในช่วง 80.4-124% แต่เมื่อความเข้มข้นของสารที่เติมลงไปต่ำกว่า 0.3 ppb (ค่า MRPL) ค่า %CV จะมีค่าสูงว่า 20% ในส่วนของ inter-variation assay จะได้ค่า%CVอยู่ในช่วง 0.01-7.43% และ %recovery อยู่ในช่วง 72.5-157% และจากการวิเคราะห์ปริมาณเปรียบเทียบโดยใช้ชุดตรวจ ELISA ต้นแบบและ LC/MS-MS พบว่าการวิเคราะห์ทั้งสองวิธีให้ผลที่ใกล้เคียงกันโดยมีค่า r² เท่ากับ 0.9809 แสดงว่าชุดตรวจสอบต้นแบบสามารถใช้วิเคราะห์ AMOZ ได้อย่างมีความถูกต้องและแม่นยำ ส่วนในกรณีของ AOZ สามารถเตรียมโมโนโคลนได้ 2 โคลนจากการหลอมรวม 5 ครั้ง แต่จากทำการศึกษาลักษณะสมบัติของแอนติบอดีที่ได้พบว่าแอนติบอดีต่อ AOZ ที่ได้มีความไวไม่เพียงพอต่อการใช้งาน จึงไม่เหมาะแก่การนำไปพัฒนาเป็นชุดตรวจต้นแบบ
Other Abstract: 3-Amino-2-oxazolidinone (AOZ) and 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidone (AMOZ) are metabolites of furazolidone and furaltadone, respectively, nitrofuran antibiotics widely used in veterinary practices both to prevent and treat infectious diseases in animals. However, both metabolites are classified as carcinogenic and mutagenic agents which pose a potential health hazard for human consumers, leading to an essential monitoring of both residues in meat products. Detection with enzyme-linked immunosorbent assay is a suitable method for screening a large number of samples. Therefore, the objectives of this research are to produce monoclonal antibodies specific to AOZ and AMOZ and to develop ELISA test kits using the obtained antibodies. Mice were immunized to produce antibodies against both metabolites and found that all immuniLed mice produced antibodies which are capable of binding to free metabolites. Then, cell fusions were performed to prepare hybridoma cells. In case of AMOZ, five fusions were performed to obtain 2l monoclones. Characterization studies of five selected monoclones revealed that isotype of mAb 1F2, 2E5.1, 5A7 and 7H8 was IgG2b and that of mAb 4F1 was IgG2a. The monoclone with highest sensitivity was 2E5.1, yielding IC₅₀ and LOD for so free AMOZ of 14.98 ppb and 4.42 ppb, respectively. This obtained mAb wais specific to CPAM0Z, NPAMOZ, AMOZ and FTD with no cross-reactivity to both tested other nitrofurans and antibiotics. The mAb was used to prepare ELISA test kits in different format. It was found that antibody captured indirect competitive ELISA (Streptavidin-HRP) gives the lowest LOD (0.06 ppb) which was lower than the MRPL value (0.3 ppb). Therefore, the efficiency of this format was evaluated using fortified shrimp samples. For intra-variation assay, %CV was in the range of 16.1 0.03% and the %recovery was in the range of 80.4-124%. However, the %CV higher than 20% was obtained when the samples were spiked at the concentration lower than 0.3 ppb. In case of inter-variation assay, the obtained %CV was 0.01-7.43% and %recovery was 72.5-l57%. The comparative analysis between the prototype ELISA and LC/MS-MS showed that both methods yielded approximate values with r² of 0.9809. These results indicated that the ELISA prototype can be used to accurately and precisely analyze AMOZ. In case of AOZ, two mAbs were obtained from five cell fusions. Unfortunately, characterization studies of these mAbs showed that they were not sensitive enough to be used. Therefore, they were not suitable for the prototype development.
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/60330
Type: Technical Report
Appears in Collections:Biotec - Research Reports

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Kittinan Ko_Res_2553.pdf4.43 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.