Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/60354
Title: Expression of novel fusion proteins IL2/FU-MK-1-scFv in microorganism-host cells and its potential anti-tumor activities as a cytotoxic immunotherapy agent for FU-MK-1 expressing tumors
Other Titles: การแสดงออกของโปรตีนเชื่อมชนิดใหม่ IL2/FU-MK-1-scFv โดยใช้จุลินทรีย์เป็นเซลล์เจ้าบ้านและทดสอบแอคติวิตีการต้านเนื้องอกของโปรตีนเชื่อมเพื่อใช้เป็นสารอิมมูโนบำบัดแบบไซโตทอกซิกต่อเนื้องอกที่มีการแสดงออกของ FU-MK-1
Authors: Suchada Chanprateep Napathorn
Tanapat Palaga
Email: Suchada.Cha@Chula.ac.th
Tanapat.P@Chula.ac.th
Other author: Chulalongkorn University. Faculty of Science
Subjects: Tumors -- Immunotherapy
Tumor suppressor proteins
Immunotherapy
เนื้องอก -- การรักษาด้วยการก่อภูมิคุ้มกัน
โปรตีนยับยั้งเนื้องอก
การรักษาด้วยการก่อภูมิคุ้มกัน
Issue Date: 2012
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: MK-1, the target molecule of FU-MK-1, is encoded by the GA733-2 gene, which is currently being used as a target in clinical trials for gastric, intestinal, and biliary cancer treatment with monoclonal antibodies. Here, two different arrangement of heavy-chain and K light-chain variable fusion gene, IL2/FUscFv(VK-VH) or IL2/FUscFv(VWVK), were constructed. The efficiency of protein expression in prokaryotic host expression system, Escherichia coli strains BL21(DE3)pLysS and Rosetta-gami B was compared with eukaryotic host expression system, Pichia pastoris strains GS115 and KM71H, for their ability to produce fusion protein. It was found that the fusion proteins were expressed in E. coli strain Rosetta-gami B in reasonable yield with high percentage of soluble form (0.25 gil of IL2/FUscFv(Vw VK) with solubility 89.29% and 0.26 gil of IL2/FUscFv(VK-VH) with solubility 84.61 %) when cultivated at 25°C, pH 7, and induced with 0.05 mM IPTG for 10 h. In comparison, P. postoris produced the secreted fusion proteins. The highest production of the fusion protein at 0.258 ± 0.013 gil was obtained under pH 3, 30°C, and induction with 0.1 % (v/v) methanol for 96 h in shaken flask cultivation. Finally, fed-batch cultivation was performed in 5 l fermenter. The highest amount of secreted fusion protein was 0.425 ± 0.002 gil. Following purification, the fusion protein was examined the specific binding activity to CHO cell expressing MK-1. The fusion protein retained the specific binding activity to MK-1 antigen due to it significantly bound to MK-1 expressing CHO cell but not MK-1 non-expressing CHO cell when compared using Student's t test (p<0 .05).
Other Abstract: ปัจจุบัน MK-1 ซึ่งเป็นโมเลกุลเป้าหมายของ FU-MK-1 และประมวลรหัสโดยยีน GA733-2 กำลังถูกใช้เป็นโมเลกุลเป้าหมายในการทดสอบทางคลินิกด้านการรักษาโรคมะเร็ง เช่น มะเร็งกระเพาะอาหาร มะเร็งลำไส้ และมะเร็งถุงน้ำดี โดยการใช้มอนอคลอนอลแอนติบอดี งานวิจัยนี้สร้างโปรตีนเชื่อมสองรูปแบบคือ IL2/FUscFv(VK-VH) และ IL2/FUscFv(VWVK), และแสดงออกในแบคทีเรีย Escherichia coli สายพันธุ์ BL21(DE3)pLysS และสายพันธุ์ Rosetta-gami B เปรียบเทียบกับการแสดงออกในยีสต์ Pichia pastoris สายพันธุ์ GS115 และสายพันธุ์ KM71H โดยแปรผันปัจจัยที่สำคัญได้แก่ pH อุณหภูมิ ความเข้มข้นของสารเหนียวนำ (IPTG หรือ เมทานอล) และระยะเวลาการเหนี่ยวนำ พบว่า E.coli แสดงออกโปรตีนเชื่อมและสะสมไว้ภายในเซลล์ โดย E.coli สายพันธุ์ Rosetta-gami B มีการแสดงออกและสะสมโปรตีนเชื่อมดีกว่า E. coli สายพันธุ์ BL21(DE3)pLysS เพราะได้โปรตีนเชื่อมที่มีเปอร์เซ็นต์การละลายน้ำสูง ผลผลิตในระดับขวดเขย่า สูงสุด IL2/FUscFv(Vw VK) เท่ากับ 0.25 กรัมต่อลิตร มีเปอร์เซ็นต์การละลายน้ำร้อยละ 89.29 และ IL2/FUscFv(Vk VH) 0.26 กรัมต่อลิตร มีเปอร์เซ็นต์การละลายน้ำร้อยละ 84.61 เมื่อเลี้ยงที่อุณหภูมิ 25°ซ pH7 และเหนี่ยวนำให้โปรตีนแสดงออกด้วย IPTG 0.05 mM นาน 10 ชั่วโมง เมื่อเปรียบเทียบเจ้าบ้านยูคาริโอต P.pastoris พบว่าการผลิตโปรตีนเชื่อมใน P.pastoris เป็นแบบหลั่งออกนอกเซลล์ ผลผลิตในระดับขวดเขย่าได้สูงสุด 0.258 ± 0.013 กรัมต่อลิตร เมื่อเลี้ยงที่อุณหภูมิ 30°ซ pH 3 และเหนี่ยวนำการแสดงออกด้วยเมทานอล 0.1% (v/v) นาน 96 ชั่วโมง การผลิตในระดับถังหมักขนาด 5 ลิตร แบบเฟดแบซได้โปรตีนเชื่อมแบบหลั่งออกนอกเซลล์สูงสุด 0.425 ± 0.02 กรัมต่อลิตร เมื่อทำบริสุทธิ์ด้วยโครมาโทกราฟีที่สัมพรรคภาพโลหะตรึง และทดสอบสมบัติการจับอย่างจำเพาะต่อเซลล์รังไข่ไขนีสแฮมส์เตอร์ (CHO) ที่มีการแสดงออก FU-MK-1 เปรียบเทียบกับเซลล์ CHO ที่ไม่มีการแสดงออก FU-MK-1 ผลการทดสอบทางสถิติด้วย Students’s t test (p<0.05) โปรตีนเชื่อมมีสมบัติการจับอย่างจำเพาะอย่างมีนัยสำคัญ
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/60354
Type: Technical Report
Appears in Collections:Sci - Research Reports

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Suchada Ch2555.pdf6.98 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.