Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/60451
Title: การผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีสำหรับตรวจวัดอะฟลาทอกซินเอ็ม1 ด้วยวิธีเอนไซม์ลิงก์อิมมิวโนซอร์เบนท์แอสเสย์
Other Titles: Production of monoclonal antibody for aflatoxin m1 detection based on enzyme-linked immunosorbent assay
Authors: กิตตินันท์ โกมลภิส
นันทิกา คงเจริญพร
ทรงจันทร์ ภู่ทอง
อณุมาศ บัวเขียว
ธนาภัทร ปาลกะ
Email: tanapat.p@chula.ac.th
Subjects: โมโนโคลนอลแอนติบอดีย์
อะฟลาท็อกซิน
เอนไซม์ลิงค์อิมมูโนซอร์เบนท์แอสเส
Monoclonal antibodies
Aflatoxins
Enzyme-linked immunosorbent assay
Issue Date: 2558
Publisher: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
Abstract: อะฟลาทอกซิน (aflatoxin, AF) เป็นกลุ่มสารพิษที่เกิดจากราซึ่งอาจปนเปื้อนอยู่ในพืชที่ใช้เป็นอาหารสัตว์ อะฟลาทอกซินหลักที่พบได้แก่ อะฟลาทอกซินบี1 อะฟลาทอกซินบี2 อะฟลาทอกซินจี1 และอะฟลาทอกซินจี2 เมื่อสัตว์ได้รับอะฟลาทอกซินชนิด บี1 (AFB1) เข้าสู่ร่างกายจะเกิดการเปลี่ยนรูปเป็นอะฟลาทอกซินชนิด เอ็ม1 (AFM1) ที่บริเวณตับและหลั่งออกมายังต่อมน้ำนม ซึ่งสารนี้เป็นสารก่อมะเร็งชนิดหนึ่ง ดังนั้นการตรวจหาปริมาณของ AFM1 ที่มีอยู่ในผลิตภัณฑ์นมจึงมีความจำเป็น ในการตรวจวัดปริมาณ AFM1 นั้นทำได้หลายวิธี โดยวิธีที่นิยมใช้ตรวจคัดกรองตัวอย่างจำนวนมากได้แก่วิธีเอนไซม์ลิงก์อิมมิวโนซอร์เบนท์แอสเสย์ (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) ในปัจจุบันชุดตรวจ AFM1 ด้วยวิธี ELISA นี้ต้องนำเข้าจากต่างประเทศ ดังนั้น งานวิจัยนี้จึงมีเป้าประสงค์เพื่อผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อ AFM1 สำหรับใช้ในการพัฒนาการตรวจด้วยวิธี ELISA โดยทำการฉีดแอนติเจน AFM1 ที่เชื่อมต่อกับอัลบูมินในซีรัมของวัว เพื่อทำการกระตุ้นภูมิคุ้มกันของหนูไมซ์สายพันธุ์ BALB/c จำนวน 5 ตัว พบว่าหนูทุกตัวตอบสนองต่อแอนติเจน โดยสร้างแอนติบอดีที่มีค่าระดับแอนติบอดีในเลือด ระหว่าง 1:8,192,000 และ 1:32,768,000 เมื่อทำการหลอมรวมเซลล์ม้ามของหนูไมซ์กับเซลล์มัยอีโลมา P3X เพื่อเตรียมโมโนโคลน พบว่าได้โมโนโคลนจำนวน 5 โคลน ได้แก่ AFM1-1, AFM1-3, AFM1-9, AFM1-15 และ AFM1-17 โมโนโคลแอนติบอดี (MAb) จากโคลนเหล่านี้มีไอโซไทป์เป็นชนิด IgG1 ทั้งหมด เมื่อทดสอบความไวของMAb ซึ่งวัดในรูปของค่าความเข้มข้นของสารที่ต่ำที่สุดที่สามารถตรวจวัดได้ (limit of detection, LOD) มีค่าเท่ากับ 16, 15, 5, 7 และ 8 พิโคกรัมต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ การทดสอบการทำปฏิกิริยาข้ามของ MAb ต่อสารต่างๆ แสดงว่า MAb เกิดปฏิกิริยาข้ามกับ AFB1 และ AFG1 แต่ไม่เกิดปฏิกิริยาข้ามกับสารนอกกลุ่มที่ใช้ทดสอบ ต่อมาได้ทำการเลือก AFM1-9 มาผลิต MAb แล้วใช้ในการเตรียม ELISA และประเมินประสิทธิภาพการตรวจวัด AFM1 ที่ถูกเติมลงไปในน้ำนมตัวอย่าง จากการทดลองพบว่า ค่าร้อยละของการได้กลับคืน และค่าร้อยละสัมประสิทธิ์ความแปรปรวนของการวิเคราะห์แบบ Intra-assay อยู่ในช่วง 92 – 104% และ 3.50 – 15.8% ตามลำดับ ส่วนการวิเคราะห์แบบ Inter-assay จะได้ค่าอยู่ในช่วง 100 – 103% และ 1.32 – 7.98% ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับผลการตรวจวัด AFM1 ระหว่างวิธีELISA และ HPLC พบว่าผลการตรวจวัดทั้งสองวิธีสอดคล้องกัน โดยมีค่า R2 เท่ากับ 0.992 จากผลการทดลองชี้ให้เห็นว่า MAb ที่ผลิตจากโมโนโคลน AFM1-9 มีความเหมาะสมสำหรับการนำมาใช้ ELISA เพื่อตรวจวัด AFM1 อย่างมีประสิทธิภาพในการตรวจคัดกรองตัวอย่างน้ำนมดิบ
Other Abstract: Aflatoxins (AFs) are the group of toxin produced from fungi which may contaminate animal feeds. The major AFs found are B₁ (AFB₁), B2, G₁ and G2. After AFB₁ enters into the animals, it is transformed to aflatoxin M₁ (AFM₁) at the liver and is secreted into the milk gland. AFM₁ is known to be a carcinogenic agent. Therefore, detection of AFM₁ presented in dairy products is essential. Detection of AFM₁ can be performed by several methods but the most widely used method suitable for screening a large number of samples is enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Currently, ELISA kit for AFM₁ must be imported. Therefore, this research aims to produce monoclonal antibody (MAb) against AFM₁ for development of ELISA. Mice (BALB/c) were immunized with AFM₁-bovive serum albumin conjugate. All mice responded to the injected antigen by producing antibody at the titer level between 1:8,192,000 and 1:32,768,000. Conventional cell fusion between splenocytes and P3X myeloma cells was performed to obtain 5 monoclones assigned as AFM₁-1, AFM₁-3, AFM₁-9, AFM₁-15 and AFM₁-17. Isotype of monoclonal antibody from these monoclones was found to be IgG1. The sensitivity of each MAb, measured in term of the lowest concentration that can be detected called limit of detection, LOD) was found to be 16, 15, 5, 7 and 9 pg/ml, respectively. Test of cross-reactivity to several substances showed that MAb cross-reacted to AFB₁ and AFG₁ but did not cross-reacted to other non-aflatoxin substances. Subsequently, AFM₁-9 was selected to produce MAb which was used in ELISA preparation and evaluation of the detection of AFM₁ fortified in milk sample. It was found that % recovery and % coefficient of variation (CV) of intra-assay was in the range of 92 – 104% and 3.50 – 15.8%, respectively. In case of inter-assay, those values were 100 – 103% and 1.32 – 7.98%, respectively. Comparative detection of AFM₁ between ELISA and HPLC illustrated that both methods were in a good agreement with the R2 of 0.992. These results indicated that MAb produced from monoclone AFM₁-9 was suitable for efficiently ELISA - screening detection of AFM₁ in raw milk samples.
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/60451
Type: Technical Report
Appears in Collections:Biotec - Research Reports

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Kittinan Ko_Res_2558.pdf773.14 kBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.