Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/60455
Title: Enhancement of recombinant monomeric insulin production in methylotrophic yeasts by increasing copy number of gene : Completed research report (2nd year)
Other Titles: การเพิ่มผลผลิตรีคอมบิแนนต์อินซูลินโดยการเพิ่มจำนวนชุดของยีนในเมธิลโลโธฟิกยีสต์ (ปีที่2) : รายงานการวิจัยฉบับสมบูรณ์
Authors: Sarintip Sooksai
Nanthika Khongchareonporn
Aphichart Karnchanatat
Shongchan Phuthong
Sajee Noitang
Sawanan Thongyoo
Email: asarintip@hotmail.com
Nanthika.K@Chula.ac.th
Aphichart.K@Chula.ac.th
No information provided
Sajee.No@Chula.ac.th
No information provided
Other author: Chulalongkorn University. The Institute of Biotechnology and Genetic Engineering
Subjects: Insulin
Insulin -- Synthesis
Methylotrophic microorganisms -- Biotechnology
Yeast
Issue Date: 2016
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: Insulin is a hormone that is produced in pancreas. It is important for regulation of blood sugar level. The active form of insulin is monomer which contains 51 amino acids in two peptide chains. Currently, improvement of insulin production was done by using recombinant DNA technology in bacteria and yeasts. The obtained recombinant insulin is easier to be purified than the pancreatic insulin. This research has been using the recombinant yeast, Pichia pastoris KM71H (TP1), which has a cassette of monomeric insulin precursor (MIP) to produce recombinant MIP. The recombinant MIP was induced to be expressed by 0.5% methanol in MMH medium. The recombinant MIP expression was detected and quantitatively determination by dot-blot analysis and indirect competitive ELISA, respectively. The expression level of recombinant MIP was 16 mg/L. The molecular weight of MIP that was determined by MALDI-TOF mass spectra technique is 5756.95 Da. The recombinant MIP was purified from culture broth by two steps, i.e. SP sepharose fast flow cation exchange chromatography and 10 kDa Amicon centrifugal molecular weight cutoff. Afterwards, it was converted to active form by TPCK tryptic hydrolysis. The tryptic digested MIP was used to test the activity through the expression of glucose transporter 4 (GLUT4) gene in H9c2 (2-1) rat myocardial cell line by real-time PCR. The results showed that the active MIP (11.20 ug/L) induced the expression of GLUT4 gene and the glucose in culture medium of H9c2 (2-1) cell line significantly reduced when the cell line was treated with the active MIP at the concentration 0.70 to 11.20 ug/L.
Other Abstract: อินซูลินเป็นฮอร์โมนที่ผลิตจากตับอ่อน มีหน้าที่ควบคุมระดับน้ำตาลในเลือด ซึ่งอินซูลินที่ออกฤทธิ์ได้จะอยู่ในรูปแบบของอินซูลินแบบมอนอเมอร์ที่ประกอบด้วยกรดอะมิโนทั้งหมด 51 ตัว และมีโครงสร้างเป็นเปปไทด์ 2 สาย ปัจจุบันมีการพัฒนาการผลิตอินซูลินให้อยู่ในรูปแบบของรีคอมบิแนนต์อินซูลินที่ผลิตโดยแบคทีเรียและยีสต์ เนื่องจากสามารถผลิตและทำบริสุทธิ์ได้ง่ายกว่าการสกัดมาจากตับอ่อนของหมูและวัว และในปัจจุบันประเทศไทยมี จำนวนผู้ป่วยโรคเบาหวานเพิ่มขึ้นทุกปี แต่ยังไม่มีการผลิตอินซูลินภายในประเทศ จึงต้องอาศัยการนำเข้าจากต่างประเทศทั้งสิ้น งานวิจัยนี้จึงสนใจที่จะนำรีคอมบิแนนต์ยีสต์ Pichia pastoris สายพันธุ์ KM71H (TP1) ซึ่งมีพลาสมิดที่มีชุดยีนผลิตรีคอมบิแนนต์อินซูลินแบบมอนอเมอร์ (MIP) มาเลี้ยงและเหนี่ยวนำให้มีการผลิตรีคอมบิแนนต์อินซูลินแบบมอนอเมอร์ซึ่งสามารถตรวจติดตามระดับการแสดงออกได้ด้วยวิธี Dot-blot analysis และสามารถวัดปริมาณรีคอมบิแนนต์อินซูลินด้วยวิธี Indirect competitive Elisa นอกจากนี้สามารถตรวจสอบน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนในอาหารเลี้ยงเชื้อได้ด้วยเครื่องวัดมวลโมเลกุล พบว่าอินซูลินที่ผลิตได้มีความเข้มข้น 16 มิลลิกรัม/ลิตร และมีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 5756.95 ดาลตัน งานวิจัยนี้ได้ทำบริสุทธิ์รีคอมบิแนนต์อินซูลินออกจากอาหารเลี้ยงเชื้อโดยใช้สองขั้นตอน ขั้นตอนแรกคือการทำบริสุทธิ์ด้วยโครมาโทกราฟีแบบแลกเปลี่ยนประจุลบชนิด SP Sepharose Fast Flow และขั้นตอนที่สองคือการใช้ Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter ขนาด 10 กิโลดาลตัน จากนั้นรีคอมบิแนนต์อินซูลินแบบมอนอเมอร์ถูกเปลี่ยนให้อยู่ในรูปที่ออกฤทธิ์ได้โดยการทำให้เกิดปฏิกิริยา การย่อยสลายด้วย เอนไซม์ทริปซิน นอกจากนี้ ได้ศึกษาผลของรีคอมบิแนนต์อินซูลินแบบมอนอเมอร์บริสุทธิ์ที่ผลิตจากยีสต์ Pichia pastoris KM17H ต่อการนำเข้ากลูโคสและการแสดงออกของยีนขนส่งน้ำตาลกลูโคส ประเภทที่ 4 โดยการวัดระดับปริมาณน้ำตาลกลูโคสในอาหารที่ลดลงด้วยเครื่องตรวจวัดระดับน้ำตาลและวัดระดับการผลิตอาร์เอ็นเอนำรหัสของตัวขนส่งน้ำตาลกลูโคส ประเภทที่ 4 (GULT 4) ในเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจหนูชนิด H9c2 (2-1) ด้วยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสที่สามารถติดตามปริมาณของผลิตภัณฑ์ที่เกิดขึ้น ณ เวลานั้นๆ โดยอาร์เอ็นเอนำรหัสของตัวขนส่งน้ำตาลกลูโคสประเภทที่ 4 มีการแสดงออกและผลิตเพิ่มมากขึ้นเมื่อมีการกระตุ้นจากอินซูลิน พบว่า เมื่อมีการกระตุ้นด้วยรีคอมบิแนนต์อินซูลิน ระดับน้ำตาลกลูโคสในอาหารจะลดลงเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่ไม่ถูกกระตุ้นด้วยอินซูลิน และในเซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วยรีคอมบิแนนต์อินซูลินที่ความเข้นข้น 11.20 มิลลิกรัม/ลิตร มีการเพิ่มการแสดงออกของอาร์เอ็นเอนำรหัสของตัวขนส่งน้ำตาลประเภทที่ 4 ที่ระยะเวลา 3 ชั่วโมง
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/60455
Type: Technical Report
Appears in Collections:Biotec - Research Reports

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Sarintip S_Res_2556.pdf1.52 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.