Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/60997
Title: ภาวะเหมาะที่สุดของการผลิตรีคอมบิแนนต์อินซูลินในยีสต์ Pichia pastoris KM71H
Other Titles: Optimization of recombinant insulin production in Pichia pastoris KM71H
Authors: กนกพัชร์ กมลจิตไพศาล
Advisors: ศรินทิพ สุกใส
ณัฏฐา ทองจุล
Other author: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์
Issue Date: 2559
Publisher: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
Abstract: ปัจจุบันมีจำนวนของผู้ป่วยโรคเบาหวานเพิ่มสูงอย่างต่อเนื่องทั้งในระดับโลกและระดับชาติ ในประเทศไทย วิกฤตนี้ได้ส่งผลให้เกิดแรงผลักดันในการผลิตอินซูลินขึ้นภายในประเทศเอง ซึ่งมีจุดประสงค์เพื่อบำบัดรักษาผู้ป่วยโรคเบาหวาน และเพื่อหลีกเลี่ยงการนำเข้าอินซูลินจากต่างประเทศด้วย อินซูลินที่ใช้ในการบำบัดรักษาผู้ป่วยนั้นสามารถผลิตได้จากหลายวิธี อาทิ การสกัดจากตับอ่อนของสัตว์ และจากกระบวนการหมักโดยใช้รีคอมบิแนนท์แบคทีเรียหรือยีสต์ ซึ่งการผลิตรีคอมบิแนนท์อินซูลินจากยีสต์ให้ผลประโยชน์ต่อการบำบัดรักษาผู้ป่วยโรคเบาหวาน เนื่องมาจาก ยีสต์จัดเป็นสิ่งมีชีวิตในกลุ่มยูคาริโอตเหมือนกับสัตว์และมนุษย์ โดยที่รีคอมบิแนนท์อินซูลินที่สังเคราะห์ได้จากยีสต์มีการดัดแปลงโมเลกุลของโปรตีนหลังการแปลรหัสที่ถูกต้อง ทั้งนี้ การทำบริสุทธิ์ของอินซูลินที่ได้จากการเลี้ยงยีสต์นั้นสามารถทำได้ง่าย เนื่องจากรีคอมบิแนนท์อินซูลินถูกหลั่งออกมาภายนอกเซลล์ของยีสต์ ในงานวิจัยนี้ได้ศึกษาถึง การผลิตรีคอมบิแนนท์อินซูลินแบบมอนอเมอร์ (MIP) โดยใช้เมธิลโลโทรฟิกยีสต์ Pichia pastoris KM71H (TP1) ที่มีชุดของยีนรีคอมบิแนนท์อินซูลินแบบมอนอเมอร์ภายใต้การควบคุมของแอลกอฮอล์ออกซิเดสโปรโมเตอร์ (AOX1P-MIP-AOX1TT) โดยศึกษาถึงผลกระทบของอาหารเลี้ยงเชื้อ ความเข้มข้นของกลีเซอรอล และไนโตรเจน ที่มีผลต่อการผลิตชีวมวลของเซลล์ในระหว่างระยะการเจริญเติบโต ซึ่งปริมาณชีวมวลของเซลล์ที่ได้จากการเลี้ยงในอาหารที่เป็นสารสกัดจากยีสต์ เปปโตน และกลีเซอรอล (YPGly) ให้ปริมาณสูงกว่าเมื่อเทียบกับการเลี้ยงใน อาหารยีสต์ไนโตรเจนเบสและกลีเซอรอล (YNBGly) ทั้งนี้ ปริมาณของเซลล์ที่สูงสุดได้มาจากการเลี้ยงเชื้อโดยใช้อาหาร YPGly ที่ประกอบไปด้วย 1% (w/v) กลีเซอรอล และ 1% (w/v) ของทั้งสารสกัดจากยีสต์ และเปปโตน ซึ่งเป็นแหล่งไนโตรเจน ในระยะของการเหนี่ยวนำนั้น เชื้อที่ได้จากระยะการเจริญเติบโตที่ถูกเลี้ยงให้เจริญในอาหาร YPGly ถูกนำมาใช้เป็นหัวเชื้อสำหรับเลี้ยงต่อในอาหารที่ใช้ในการผลิตรีคอมบิแนนท์อินซูลิน โดยผลกระทบของอาหารเลี้ยงเชื้อ ปริมาณของหัวเชื้อ และเมทานอลที่ใช้ในการเหนี่ยวนำให้เกิดการผลิตรีคอมบิแนนท์อินซูลินถูกนำมาศึกษา จากการศึกษาพบว่า ปริมาณของรีคอมบิแนนท์อินซูลินที่มากที่สุดเท่ากับ 23.67±0.04 มิลลิกรัมต่อลิตร ซึ่งใช้ระยะเวลาในการเลี้ยงเชื้อทั้งสิ้นเป็น 48 ชั่วโมง โดยใช้ความเข้มข้นของหัวเชื้อเป็นแบบเข้มข้นขึ้น (5X) และการใช้ความเข้มข้นของเมทานอล 1% (v/v) ในอาหารเป็นปริมาณที่เหมาะสมที่สุดต่อการเหนี่ยวนำให้เกิดการผลิตรีคอมบิแนนท์อินซูลิน โดยทำการเติมทุก 24 ชั่วโมง
Other Abstract: Nowadays, a number of diabetic patients continousuly increase at national and global levels. In Thailand, this crisis has driven the local insulin production in order for serving therapeutic purpose and avoiding import of insulin products from abroad. Therapeutic insulin can be produced in many ways, e.g., extraction from animal pancreas and fermentation using recombinant bacteria or yeast. Among these, recombinant insulin production from yeast provided beneficial outcomes for therapeutic application since yeasts were classified in Eukaryota similarly to animal and human. Recombinant insulin synthesized from yeast could therefore have a correct posttranslation. Purification of insulin by yeast fermentation was simple since the recombinant product was secreted from the yeast cells. In this research, recombinant insulin monomer production (MIP) from methylotrophic yeast Pichia pastoris KM71H (TP1) containing recombinant monomeric insulin precursor gene cassette under alcohol oxidase controlled promoter (AOX1P-MIP-AOX1TT) was investigated. The effects of culture media as well as the concentrations of glycerol and nitrogen on cell biomass production was observed during the growth phase. Higher cell biomass was obtained from the fermentation of yeast extract peptone glycerol (YPGly) medium compared with that of yeast nitrogen base glycerol (YNBGly) medium. The highest cell biomass was acquired from the culture using YPGly containing 1% (w/v) glycerol and 1% (w/v) each of yeast extract and peptone (nitrogen source). In the induction phase, the culture from the growth phase grown in YPGly medium was inoculated into the production medium. The effects of medium, inoculum size, and methanol induction on recombinant insulin production were investigated. From the study, it was found that the highest recombinant insulin production of 23.67±0.04 mg.l-1 was achieved at 48 h fermentation when inoculating with the concentrated inoculum (5X). Methanol concentration of 1% was proper for inducing insulin production every 24 h.
Description: วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2559
Degree Name: วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต
Degree Level: ปริญญาโท
Degree Discipline: เทคโนโลยีชีวภาพ
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/60997
Type: Thesis
Appears in Collections:Sci - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
5771905723.pdf5.77 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.