Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/61016
Title: Free radical scavenging and antiproliferation of peptide from chicken feather meal
Other Titles: ฤทธิ์ขจัดอนุมูลอิสระและยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์มะเร็งของเพปไทด์จากขนไก่ป่น
Authors: Pichamon Jeampakdee
Advisors: Aphichart Karnchanatat
Other author: Chulalongkorn University. Faculty of Science
Issue Date: 2016
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: A free radical is an atom or compound, which contains a lone pair electron reactive to cells and molecules in the human body. The free radical cannot be eliminated and plays an important role in many diseases such as coronary thrombosis, cancer, Alzheimer’s, and arthritis. The antioxidant system in the body is one of the mechanisms that respond to free radicals. In this research peptides from chicken feather meal protein hydrolysates with microbial proteases (Alcalase®, Flavourzyme® and Neutrase®) were prepared and their antioxidant activities determined. Peptide fractions derived from chicken feather meal hydrolyzed by 5% Neutrase®, shown the highest DPPH and ABTS radical scavenging activity with IC50 values of 16.45±0.23 and 9.34±0.08 µg/mL, respectively. Peptide fractions were fractionated using molecular weight cut-offs of 10, 5, 3 and 0.65 kDa membranes and their antioxidant properties further analyzed. Of the fractions, MW < 0.65 kDa (F5 fraction) exhibited high levels of free radical scavenging activities towards DPPH and ABTS with IC50 values of 1.72±0.04 and 0.42±0.02 µg/mL, respectively. The F52 fraction from Superdex® 75 column presented the highest scavenging activities on DPPH and ABTS radicals with IC50 values of 7.35±0.30 and 14.79±0.24 µg/mL, respectively. The F52 fraction was purified using RP-HPLC and separated into three fractions (F521, F522, and F523). All fractions exhibited very strong DPPH radical scavenging activities (32.01±2.17, 22.52±4.87 and 59.66±5.89 µg/mL), and all fractions were identified by mass spectrometry as Phe-Asp-Asp-Arg-Gly-Arg-X (FDDRGRX, 875 Da), Val-Thr-Leu-Ala-Val-Thr-Lys-His (VTLAVTKH, 868 Da) and Val-Ser-Glu-Ile-X-Ser-Ile-Pro-Ile-Ser (VSEIXSIPIS, 1,055 Da), respectively. Furthermore, the F52 fraction could protect hydroxyl radical-induced DNA damage as shown in pKS, pUC19, and pBR322. In addition, as concerns cancer, the F52 fraction possessed high antiproliferative activity in human SW620 colon cancer cell lines using an MTT assay with IC50 values of 26.37±2.87 µg/mL, and 0.5% of the F52 fraction (protein content as 0.31 µg/mL) could induce apoptosis as measured by an FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit with PI using flow cytometry and increased caspase 3 and 8 activities in SW620 cells for 24 and 48 h. Hence, F52 fraction could be used as a new natural antioxidant and source of antiproliferative activities for drug development.
Other Abstract: อนุมูลอิสระคืออะตอมหรือสารประกอบที่ประกอบด้วยอิเล็กตรอนโดดเดี่ยว สามารถทำปฏิกิริยากับเซลล์และโมเลกุลต่าง ๆ ในร่างกาย อนุมูลอิสระเหล่านี้ไม่สามารถถูกกำจัดและอาจก่อให้เกิดโรคหลายโรค ยกตัวอย่างเช่น โรคหลอดเลือดหัวใจตีบ โรคมะเร็ง โรคสมองเสื่อม และโรคไขข้ออักเสบ เป็นต้น ระบบป้องกัน ยับยั้ง หรือขจัดอนุมูลอิสระในร่างกายเป็นระบบหนึ่งที่มีความสำคัญต่อการขจัดอนุมูลอิสระเหล่านี้ให้หมดไป ดังนั้นจึงทำการศึกษาและเตรียมเพปไทด์จากขนไก่ป่นโดยการย่อยด้วยเอนไซม์จากจุลินทรีย์ ได้แก่ แอลคาเลส ฟลาโวไซม์ และนิวเทรส และศึกษาความสามารถในการขจัดอนุมูลอิสระพบว่าเพปไทด์จากขนไก่ป่นที่ถูกย่อยด้วยเอนไซม์นิวเทรส ความเข้มข้นร้อยละ 5 มีความสามารถในการขจัดอนุมูลอิสระสูงที่สุดเมื่อวิเคราะห์ความสามารถในการขจัดอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH และ ABTS radical scavenging activity โดยแสดงค่าความเข้มข้นต่ำสุดที่สามารถยับยั้งอนุมูลอิสระได้ร้อยละ 50 (IC50) เท่ากับ 16.45±0.23 และ 9.34±0.08 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ ต่อมาคัดแยกเพปไทด์ที่ได้ตามขนาดโมเลกุล ได้แก่ 10 5 3 และ 0.65 กิโลดาลตัน ด้วยเทคนิคอัลตราฟิลเตรชันและวิเคราะห์ความสามารถในการขจัดอนุมูลอิสระพบว่าเพปไทด์ที่มีขนาดโมเลกุลน้อยกว่า 0.65 กิโลดาลตัน (เพปไทด์ F5) สามารถขจัดอนุมูลอิสระเมื่อวิเคราะห์ด้วยวิธี DPPH และ ABTS radical scavenging activity ได้สูงที่สุดโดยแสดงค่าความเข้มข้นต่ำสุดที่สามารถยับยั้งอนุมูลอิสระได้ร้อยละ 50 (IC50) เท่ากับ 1.72±0.04 และ 0.42±0.02 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ จากนั้นนำเพปไทด์ที่มีขนาดน้อยกว่า 0.65 กิโลดาลตัน มาทำให้บริสุทธิ์ด้วยเทคนิคเจลฟิลเตรชันโครมาโตรกราฟีโดยใช้คอลัมน์ Superdex® 75 พบว่าเพปไทด์ F52 มีความสามารถในการขจัดอนุมูลอิสระได้สูงที่สุดเมื่อวิเคราะห์ด้วยวิธี DPPH และ ABTS radical scavenging activity โดยแสดงค่าความเข้มข้นต่ำสุดที่สามารถยับยั้งอนุมูลอิสระได้ร้อยละ 50 (IC50) เท่ากับ 7.35±0.30 และ14.79±0.24 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ ต่อมานำเพปไทด์ F52 ที่ได้มาทำให้บริสุทธิ์และพิสูจน์เอกลักษณ์ด้วยเทคนิคโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูงและเทคนิคแมสสเปกโตรเมตรี ตามลำดับ พบว่าเพปไทด์ F52 สามารถแยกได้เป็นเพปไทด์ 3 ชนิด ได้แก่ Phe-Asp-Asp-Arg-Gly-Arg-X (FDDRGRX หรือ F521 มีขนาดโมเลกุลคือ 875 ดาลตัน) Val-Thr-Leu-Ala-Val-Thr-Lys-His (VTLAVTKH หรือ F522 มีขนาดโมเลกุลคือ 868 ดาลตัน) และ Val-Ser-Glu-Ile-X-Ser-Ile-Pro-Ile-Ser (VSEIXSIPIS หรือ F523 มีขนาดโมเลกุลคือ 1055 ดาลตัน) และมีความเข้มข้นต่ำสุดที่สามารถยับยั้งอนุมูลอิสระได้ร้อยละ 50 (IC50) เท่ากับ 32.01±2.17 22.52±4.87 และ 59.66±5.89 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ เมื่อวิเคราะห์ความสามารถในการขจัดอนุมูลอิสระด้วยวิธี DPPH radical scavenging activity นอกจากนี้ได้มีการนำเพปไทด์ F52 มาศึกษาความสามารถในการป้องกันการถูกทำลายของดีเอ็นเอจากพลาสมิด 3 ชนิด ได้แก่ pKS pUC19 และ pBR322 ด้วยอนุมูลไฮดรอกซี พบว่าเพปไทด์ F52 มีความสามารถในการป้องกันไม่ให้ดีเอ็นเอถูกทำลายไป และจากการศึกษาความสามารถในการยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์มะเร็งของเพปไทด์ F52 ด้วยวิธี MTT พบว่าเพปไทด์ F52 มีความสามารถในการยับยั้งการเพิ่มจำนวนเซลล์มะเร็งลำไส้ SW620 ได้สูงที่สุด อีกทั้งยังไม่เป็นพิษต่อเซลล์ โดยแสดงค่าความเข้มข้นต่ำสุดที่สามารถยับยั้งเซลล์มะเร็งได้ร้อยละ 50 (IC50) เท่ากับ 26.37±2.87 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร นอกจากนี้เมื่อนำเพปไทด์ F52 ความเข้มข้นร้อยละ 0.5 (ปริมาณโปรตีนเท่ากับ 0.31 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร) มาบ่มกับเซลล์มะเร็งลำไส้ SW620 พบว่าที่เวลา 24 และ 48 ชั่วโมง เพปไทด์ F52 ความเข้มข้นร้อยละ 0.5 (ปริมาณโปรตีนเท่ากับ 0.31 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร) มีความสามารถในการชักนำให้เซลล์มะเร็งลำไส้ SW620 เกิดการตายแบบอะพอพโทซิสโดยใช้ชุดสีย้อม FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit with PI และวิเคราะห์เปอร์เซ็นต์การตายแบบอะพอพโทซิสด้วยเทคนิคโฟลไซโทเมทรี นอกจากนี้ยังพบการเพิ่มขึ้นของการทำงานของเอนไซม์แคสเปส 3 และ 8 อีกด้วย ดังนั้นจึงสามารถสรุปได้ว่าเพปไทด์ F52 ที่เตรียมได้จากขนไก่ป่นสามารถใช้เป็นสารต้านอนุมูลอิสระและต้านการเพิ่มจำนวนเซลล์มะเร็งแหล่งใหม่ที่ได้จากธรรมชาติเพื่อนำไปประยุกต์ใช้ในด้านการพัฒนายาต่อไป
Description: Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 2016
Degree Name: Master of Science
Degree Level: Master's Degree
Degree Discipline: Biotechnology
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/61016
Type: Thesis
Appears in Collections:Sci - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
5772242423.pdf2.39 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.