Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/12505
Title: Detection of cyclodextrin glycosyltransferase gene by synthetic oligonucleotide probes
Other Titles: การตรวจหายีนของไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคซิลทรานสเฟอเรส โดยตัวติดตามชนิดโอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์
Authors: Surasak Laloknam
Advisors: Piamsook Pongsawasdi
Vichien Rimphanitchayakit
Other author: Chulalongkorn University. Graduate School
Advisor's Email: Piamsook.P@chula.ac.th
Vichien.R@Chula.ac.th
Subjects: Cyclodextin glycosyltrasferase
Oligonucleotides
Issue Date: 1997
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) from Bacillus sp. All was purified approximately 44.8 folds with a 30% yield and specific activity of 5,000 units/mg protein by corn starch adsorption, ammonium sulfate precipitation, and DEAE-cellulose column chromatography. Detection on non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis of the purified enzyme revealed a major and minor bands which corresponded to those of amylolytic and CD-forming activities. The intense protein band was found when sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis was performed. When the purified enzyme was determined for its amino acid composition, 60 mol% of content was polar amino acids: aspartic acid, asparagine, glutamic acid, and glutamine was rather high (25 mol%). The amino acid sequence of 20 residues at N-terminal was determined to be ala, pro, asp, thr, ser, asn, tyr, asn, lys, glu, asn, phe, arg, tyr, asp, val, ile, gln, and ile, respectively. The two oligonucleotides containing 17 bases were designed by deducing the N-and C-terminal amino acid sequences, and named PNB 5' HO-GTA(C/T)TATGATGTCAGCG-OH 3' and PCC 5' HO-CAACAAGCA(G/C)AATTTCC-OH 3', respectively. Both synthetic oligonucleotides were labeled at 5' end with [gamma-32P] and used as probe for the first screening of CGTase by colony hybridization. Partially Sau3AI-digested chromosomal DNA from Bacillus sp. All was ligated to BamHI-digested pUC18 and transformed into E. coli strain DH5alpha. Five CGTase-producing transformants were screened and isolated by colony hybridization, starch hydrolysis and clear zone detection, dextrinizing activity, phenol red inclusion complex test, and CD-trichloroethylene assay. Transformant 909 showed the highest activity but lower activity than Bacillus sp. All. Localization of CGTase in transformant 909 was determined and 87.5%, 11.2%, and 1.3% of dextrinizing activity were found in extracellular enzyme, periplasmic space, and cell pellet, respectively. HPLC analysis of products showed that ratio of alpha-:beta-:gamma-CD was 1:4.6:1.6. Crude CGTase of transformant 909 showed the same electrophoretic patterns as that of Bacillus sp. All when analyzed by non-denaturing and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
Other Abstract: ไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคซิลทรานสเฟอเรสจากเชื้อ Bacillus sp. All ผ่านการทำให้บริสุทธิ์โดยการดูดซับด้วยแป้ง ตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตที่ความเข้มข้นอิ่มตัว 40-80 เปอร์เซ็นต์ และโครมาโตกราฟีแบบคอลัมน์ ดีอีเออี-เซลลูโลส มีแอคติวิตีจำเพาะ 5,000 ยูนิต/มิลลิกรัม โปรตีน มีความบริสุทธิ์ 44.8 เท่า และให้ผลผลิต 30 เปอร์เซ็นต์ เมื่อทำการตรวจสอบความบริสุทธิ์และแอคติวิตีของเอนไซม์ด้วยพอลีอะครีละไมล์เจลอิเลคโตรโฟรีซีสแบบไม่เสียสภาพ พบว่า เอนไซม์บริสุทธิ์ให้แถบโปรตีนตรงกับแถบอะไมโลไลติกแอคติวิตี และ CD-forming แอคติวิตี 2 แถบ คือ แถบเข้มและแถบจาง และพบโปรตีนแถบสำคัญแถบเดียวในระบบเจลที่มีโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต เมื่อนำเอนไซม์บริสุทธิ์ไปหาองค์ประกอบของกรดอะมิโนพบว่ามีกรดอะมิโนประเภทโพลาร์ประมาณ 60 โมลเปอร์เซ็นต์ ซึ่งเป็นกรดอะมิโนชนิด acidic อันได้แก่ กรดแอสพาติก แอสพาราจีน กรดกลูตามิก และกลูตามีน ในปริมาณสูง (ประมาณ 25 โมลเปอร์เซ็นต์) จากนั้นได้หาลำดับกรดอะมิโนที่ด้านปลายอะมิโน 20 ตัวแรก พบว่าเป็น ala, pro, asp, thr, ser, asn, tyr, asn, lys, glu, asn, phe, arg, tyr, asp, val, ile, gln, และ ile ตามลำดับ การออกแบบโอลิโกนิวคลีโอไทด์ขนาด 17 เบส 2 สาย จากการเปลี่ยนรหัสลำดับกรดอะมิโนทางด้านปลายอะมิโนที่หาได้ส่วนทางด้านปลายคาร์บอกซิล มาจากการเปรียบเทียบกรดอะมิโนของ CGTase จาก Bacillus sp. All กับแบคทีเรียสายพันธุ์อื่นที่ผลิต CGTase ให้ชื่อว่า PNB 5' HO-GTA (C/T) TATGATGTCAGCG-OH 3' และ PCC 5' HO-CAACAAGCA(G/C)AATTTCC-OH 3' ตามลำดับ แล้วทำการติดฉลากด้วย [gamma-32P] ที่ปลาย 5' [PO4]3- ของโอลิโกนิวคลีโอไทด์แล้วใช้เป็นตัวติดตามยีน CGTase ซึ่งเตรียมโดยการนำดีเอ็นเอของโครโมโซมจาก Bacillus sp. All ที่ย่อยด้วยเรสติกชันเอนไซม์ Sau 3AI แบบไม่สมบูรณ์มาเชื่อมกับตำแหน่ง BamHI บนเวกเตอร์ pUC18 แล้วเคลื่อนย้ายรีคอมบิแนนท์พลาสมิดเข้าสู่เซลล์เข้าเรือน E. coli strain DH5alpha โดยการติดตามด้วยวิธีโคโลนีไฮบริไดเซชัน วิธีติดตามแอคติวิตีในการย่อยแป้งแล้วเกิด clear zone และติดตามแอคติวิตีในหลอดทดลองดด้วยวิธี Dextrinizing activity, Phenol red inclusion complex test (PICT) และ CD-trichloroethylene assay พบว่ามี 5 ทรานสฟอร์แมนท์ที่สามารถผลิต CGTase โดย ทรานสฟอร์แมนท์ 909 แสดงแอคติวีตีสูงที่สุดแต่ต่ำกว่า Bacillus sp. All ดังนั้นจึงทำการศึกษาแหล่งที่ให้ Dextrinizing activity พบว่า ที่บริเวณนอกเซลล์ periplasmic space และตะกอนเซลล์มีแอคติวิตี 87.5, 11.7 และ 1.3 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ ผลการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ CDs ด้วย HPLC พบว่า CGTase ของทรานสฟอร์มแมนท์ 909 ให้อัตราส่วน alpha-:beta-:gamma-CD เป็น 1:4.6:1.6 และแสดงสมบัติเหมือน CGTase ของ Bacillus sp. All เมื่อตรวจสอบด้วยพอลีอะครีละไมล์เจลอิเลคโตรโฟรีซีส
Description: Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 1997
Degree Name: Master of Science
Degree Level: Master's Degree
Degree Discipline: Biochemistry
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/12505
ISBN: 9746390724
Type: Thesis
Appears in Collections:Grad - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Surasak_La_front.pdf771.47 kBAdobe PDFView/Open
Surasak_La_ch1.pdf1.17 MBAdobe PDFView/Open
Surasak_La_ch2.pdf1.27 MBAdobe PDFView/Open
Surasak_La_ch3.pdf1.89 MBAdobe PDFView/Open
Surasak_La_ch4.pdf926.74 kBAdobe PDFView/Open
Surasak_La_ch5.pdf207.35 kBAdobe PDFView/Open
Surasak_La_back.pdf1.34 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.