การใช้ดีเอ็นเอไฮบริไดเซชั่นในการพิสูจน์เอกลักษณ์ของ Tetragenococccus species ที่แยกได้จากการหมักน้ำปลา

Abstract

งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาแบคทีเรียกรดแลคติคชอบเค็มในกระบวนการหมักน้ำปลาตั้งแต่เริ่มต้นจนกระทั่งสิ้นสุดการหมัก (0-18 เดือน) ในโรงงาน A B และ C โดยใช้อาหารเลี้ยงเชื้อเอ็มอาร์เอสที่เติมโซเดียมคลอไรด์ 5 เปอร์เซนต์ พบจำนวนแบคทีเรียทนเค็มและชอบเค็มทั้งหมดของโรงงาน A อยู่ในช่วง 6.50 x 10-8.25 x 10 x 10 x 10 x 10 x 10 CFU/ml โรงงาน B อยู่ในช่วง 0-2.40 x 10 x 10 x 10 x 10 CFU/ml และโรงงาน C อยู่ในช่วง 0-9.90 x 10 x 10 x 10 x 10 CFU/ml แยกได้แบคทีเรียกรดแลคติคชอบเค็มทั้งหมด 389 สายพันธุ์ จากโรงงาน A 266 สายพันธุ์ โรงงาน B 100 สายพันธุ์ และโรงงาน C23 สายพันธุ์ ผลการวิเคราะห์คุณสมบัติทางเคมีของตัวอย่างน้ำปลาจากโรงงาน A B และ C พบว่ามีค่าพีเอชอยู่ระหว่าง 4.99-6.31, 5.06-5.69 และ 4.78-6.30 ปริมาณกรดแลคติคอยู่ระหว่าง 0.76-2.92, 0.90-3.70 และ 0.20-3.74 เปอร์เซนต์ และปริมาณโซเดียมคลอไรด์อยู่ระหว่าง 18.25-23.62, 19.25-31.00 และ 22.00-32.50 เปอร์เซนต์ ตามลำดับ จากการศึกษารูปแบบการหมักน้ำตาล 6 ชนิด คือ เมเลซิโทส อะราบิโนส มอลโทส กาแลคโทส ไซโลส และไรโบส เพื่อจัดกลุ่มแบคทีเรียกรดแลคติคชอบเค็ม พบว่าแบคทีเรีย 389 สายพันธุ์ จากโรงงาน A B และ C มีรูปแบบการหมักน้ำตาล 24 รูปแบบ คัดเลือกตัวแทนแบคทีเรียจาก 24 รูปแบบของการหมักน้ำตาลรวม 174 สายพันธุ์ เพื่อศึกษาลักษณะทางฟีโนไทป์ พบว่า สามารถพิสูจน์เอกลักษณ์ของแบคทีเรียได้เป็น Tetragenococcus sp. 172 สายพันธุ์ และอีก 2 สายพันธุ์ ไม่สามารถจัดจำแนกได้จัดกลุ่มแบคทีเรีย 174 สายพันธุ์ โดยใช้รูปแบบของฟีโนไทป์เป็น 6 กลุ่ม และคัดเลือกตัวแทน 80 สายพันธุ์ เพื่อศึกษาความคล้ายคลึงทางดีเอ็นเอโดยใช้เทคนิคดีเอ็นเอไฮบริไดเซชั่นในไมโครเพลต โดยการติดฉลากโพรบดีเอ็นเอด้วยโฟโตไบโอติน พบว่า สามารถแบ่งแบคทีเรียทั้ง 80 สายพันธุ์ ได้เป็น 3 กลุ่ม กลุ่มที่ 1 มี 40 สายพันธุ์ มีเปอร์เซ็นต์ความคล้ายคลึงทางดีเอ็นเอกับแบคทีเรีย T.halophilus สายพันธุ์มาตรฐาน ATCC 33315T เท่ากับ 70.03-109.05 เปอร์เซนต์ จึงจัดเป็นแบคทีเรีย T.halophilus กลุ่มที่ 2 มี 38 สายพันธุ์มีเปอร์เซนต์ความคล้ายคลึงทางดีเอ็นเอกับ T.muriaticus สายพันธุ์มาตรฐาน JCM 10006T เท่ากับ 70.94-105.60 เปอร์เซนต์ จึงจัดเป็น T.muriaticus กลุ่มที่ 3 มี 2 สายพันธุ์ ไม่มีความคล้ายคลึงทางดีเอ็นเอกับ T.halophilus ATCC 33315T, T.muriaticus JCM 10006T และ Aerococcus viridans TISTS 393T เท่ากับ 3.69-16.30 เปอร์เซนต์ จึงไม่สามารถระบุสปีชีส์ได้ คัดเลือกตัวแทนของ Tetragenococcus sp. เพื่อศึกษาการสร้างฮีสตามีน, ไอโซเมอร์ของกรอแลคติค และองค์ประกอบ กรดไขมันของเซลล์ พบว่าแบคทีเรียสามารถสร้างฮีสตามีนได้ปริมาณ 0.036-52.29 มิลลิกรัมต่อ 100 มิลลิลิตรของอาหาร ไอโซเมอร์ของกรดแลคติคเป็นชนิดแอล และมีองค์ประกอบกรดไขมันของเซลล์ชนิด C18:1 เป็นองค์ประกอบหลัก จากการศึกษาอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสม พบว่า อาหารเลี้ยงเชื้อเอ็มอาร์เอสที่ลดปริมาณกลูโคสเป็น 0.5 เปอร์เซนต์ เหมาะสำหรับการเจริญของ T. halopkilus และที่เติมโซเดียมคลอไรด์ 10 เปอร์เซนต์ เหมาะสำหรับการเจริญของ T. muriaticus นอกจากนี้ในงานวิจัยนี้ยังได้ทำการทดลองเบื้องต้นในการเตรียมหัวเชื้อบริสุทธิ์ พบว่า การเก็บเชื้อในอาหารเลี้ยงเชื้อปลาป่นผสมกับรำข้าวที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เป็นวิธีที่ให้เปอร์เซนต์การรอดชีวิตของแบคทีเรียกรดแลคติกชอบเค็มได้มากที่สุด