Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/25002
Title: Purification and biochemical characterization of cyclodextrin glycosyltransferase from thermotolerant Paenibacillus sp. strain RB01
Other Titles: การทำให้บริสุทธิ์และลักษณะสมบัติทางชีวเคมีของไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคซิลทรานสเฟอเรสจาก Paenibacillus sp. ทนร้อนสายพันธุ์ RB01
Authors: Wanchai Yenpetch
Advisors: Piamsook Pongsawasdi
Other author: Chulalongkorn University. Faculty of Science
Subjects: Biochemistry
Cyclodextrins -- Purification
Issue Date: 2002
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) catalyzes the conversion of starch to cyclodextrin (CD). The enzyme from a thermotolerant Paenibacillus sp. strain RB01 isolated from hot spring area in Ratchaburi province, Thailand, was purified and characterized. Purification steps involved starch adsorption, DEAE-cellulose and Bio-Gel P-100 column chromatography. Final purification fold was 47.5 and the yield obtained was 35%. The purified CGTase showed a single band on SDS-PAGE with the molecular weight of 65 kDa. On native PAGE, one major with two minor protein bands which corresponded to bands obtained from dextrinizing activity were observed. The result suggests the existence of 3 isoforms of the same size of this CGTase. However, they showed small difference in net charge as evidenced by their closed relative mobilities on native PAGE. In addition, by isoelectric focusing, two major bands were found at pI of 5.2 and 5.3 with one minor band at 5.1. The enzyme was found to be a glycoprotein due to positive staining with PAS. By HPLC analysis of reaction products, it was found that this CGTase hydrolyzed soluble starch to form α:β:γ-CD in the ratio of 1.0:1.8:0.4. Optimum pH and temperature for dextrinizing activity were 5.0 and 65 ℃, for cyclizing activity were 7.0 and 70 ℃, and for CD-TCE activity were 7.0-9.0 and 55 ℃. The enzyme was stable at pH 7-9 and temperature of 45-55 ℃ within 60 min incubation period. At 70 ℃, in the presence of soluble starch substrate, no activity was lost after 30 min incubation while only 20% was lost after 60 min. The enzyme was chemically modified with a series of group-specific reagents to identify essential amino acid residues. Incubation of the enzyme for 5 min with 5, 1.5 and 0.005 mM of 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), diethylpyrocarbonate (DEP) and N-bromosuccinimide (NBS) which were specific for carboxyl, histidine, and tryptophan residues, respectively, led to complete loss of enzyme activity. In the presence of protective substance, α-, β-, or γ-CD, the loss of activities were reduced. These results suggested that carboxyl, histidine and tryptophan were located at the active site. In addition, it was proved that cystein, tyrosine, lysine, and serine were not important residues for enzyme activity. The enzyme was found to be specific for substrates with α-1, 4 glucosidic linkage, and G3 was the smallest saccharide acting as substrate. For kinetic parameters on CD coupling activity, enzyme efficiency (kcat/Km) was higher for native than for modified CDs. Turnover number (kcat) showed similar trend as that of β- ≅ γ- > α > modified CDs. The result from urea-induced denaturation of CGTase suggested that multiple forms of the enzyme did not arise from different tertiary structure of protein.
Other Abstract: ไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคซิลทรานสเฟอเรส ( CGTase ) เป็นเอนไซม์เร่งปฏิกิริยาการเปลี่ยนแป้งให้เป็นไซโคลเดกซ์ทริน (CD) แบคทีเรียทนร้อนสายพันธุ์ RB01 ซึ่งคัดแยกจากบ่อน้ำร้อน จังหวัดราชบุรี ประเทศไทย ถูกทำให้บริสุทธิ์ขึ้นด้วยการดูดซับด้วยแป้ง คอลัมน์ DEAE-cellulose และ Bio-Gel P-100 พบว่าเอนไซม์บริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 47.5 เท่า และมีแอคติวิตีคงเหลือ 35 เปอร์เซ็นต์ เอนไซม์บริสุทธิ์แสดงแถบโปรตีน 1 แถบซึ่งมีมวลโมเลกุล 65 kDa บน SDS-PAGE แต่แสดง 1 แถบหลักกับ 2 แถบรองบน native PAGE โดยที่ทุกแถบแสดงผลบวกเมื่อย้อมแอคติวิตี ( dextrinizing activity ) แต่ละแถบมีความแตกต่างด้านประจุเล็กน้อยโดยเมื่อตรวจสอบด้วย isoelectric focusing ก็พบว่าแถบโปรตีนหลักมีค่า pI 5.2 และ 5.3 ส่วนแถบโปรตีนรองมีค่า 5.1 แสดงว่าเอนไซม์นี้มี 3 isoforms ที่มีขนาดเท่ากัน จากการย้อมเอนไซม์ด้วย PAS พบว่าเอนไซม์นี้เป็นไกลโคโปรตีน ซึ่งสามารถย่อยสับสเตรท soluble starch ให้เกิดผลิตภัณฑ์ เมื่อตรวจสอบด้วย HPLC มีอัตราส่วนของ α-:β-:γ-CD เป็น 1.0:1.8:0.4 เอนไซม์มี pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมในการเกิดปฏิกิริยาแตกต่างกันโดยปฏิกิริยา dextrinization คือ 5.0 และ 65 ℃ ส่วนปฏิกิริยา cyclization คือ 7.0 และ 70 ℃ และสำหรับปฏิกิริยา CD-TCE คือ 7.0-9.0 และ 55 ℃ เมื่อบ่มเอนไซม์ไว้ที่ pH 7-9 ในช่วงอุณหภูมิ 45-55 ℃ เป็นเวลา 60 นาที เอนไซม์ ยังคงมีแอคติวิตีอยู่ประมาณ 80% ในขณะที่เมื่อบ่มเอนไซม์กับ soluble starch ที่ 70 ℃ 30 นาที พบว่าเอนไซม์ไม่เสียแอคติวิตีเลยและเมื่อบ่มไว้นาน 60 นาที แอคติวิตีลดลงเพียง 20% ในการดัดแปลงกรดอะมิโนด้วยสารเคมีที่จำเพาะเพื่อพิสูจน์กรดอะมิโนสำคัญโดยบ่มเอนไซม์ 5 นาทีกับ 5.0, 1.5 และ 0.005 มิลลิโมลาร์ ของ 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), diethylpyrocarbonate (DEP) และ N-bromosuccinimide (NBS) ซึ่งจำเพาะต่อกรดอะมิโนคาร์บอกซิล ฮิสติดีนและทริปโตเฟนตามลำดับ พบว่าเอนไซม์จะเสียแอคติวิตีทั้งหมด เมื่อป้องกันเอนไซม์ด้วยสับสเตรท คือ α-, β-, หรือ γ-CD ก่อนการดัดแปลงพบว่าการสูญเสียแอคติวิตีลดลง จากผลการทดลองนี้แสดงว่ากรดอะมิโนคาร์บอกซิล ฮิสติดีนและทริปโตเฟน เป็นกรดอะมิโนสำคัญในบริเวณเร่งของเอนไซม์ กรดอะมิโนซิสเตอีน, ไทโรซีน, ไลซีน, และเซรีนอาจไม่ใช่กรดอะมิโนสำคัญสำหรับการแสดงแอคติวิตี เอนไซม์มีความจำเพาะต่อสับสเตรทที่มีโครงสร้าง α-1, 4 กลูโคส โดย G3 เป็นสับสเตรทที่เล็กที่สุด ผลการศึกษาค่าจลนพลศาสตร์ของปฏิกิริยาควบคู่ พบว่าเอนไซม์มีประสิทธิภาพ (kcat/Km) ในการเร่งปฏิกิริยาสูงสำหรับ CD รูปแบบธรรมชาติมากกว่ารูปแบบอนุพันธ์ ค่าจำนวนหมุนเวียน (kcat) ก็แสดงแนวโน้มคล้ายกัน คือ ค่าสำหรับ β- ≅ γ- > α- > CDs ในรูปแบบอนุพันธ์ จากการชักนำการเสียสภาพ CGTase ด้วยยูเรีย ทำให้คาดการณ์ได้ว่าการเกิดหลายรูปแบบของเอนไซม์ไม่ได้เกิดจากโครงรูปการพับของโปรตีนที่ต่างกัน
Description: Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 2002
Degree Name: Master of Science
Degree Level: Master's Degree
Degree Discipline: Biochemistry
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/25002
ISBN: 9741729138
Type: Thesis
Appears in Collections:Sci - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Wanchai_ye_front.pdf3.88 MBAdobe PDFView/Open
Wanchai_ye_ch1.pdf6.35 MBAdobe PDFView/Open
Wanchai_ye_ch2.pdf5.04 MBAdobe PDFView/Open
Wanchai_ye_ch3.pdf8.14 MBAdobe PDFView/Open
Wanchai_ye_ch4.pdf5.26 MBAdobe PDFView/Open
Wanchai_ye_ch5.pdf473.25 kBAdobe PDFView/Open
Wanchai_ye_back.pdf5.81 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.