การทำให้บริสุทธิ์และลักษณะสมบัติทางชีวเคมีของไซลาเนสจากผลกล้วยน้ำว้า Musa sapientum

Abstract

ในการตรวจหาเอนไซม์ไซลาเนส (E.C.3.2.1.8) ในผลกล้วยน้ำว้าในแต่ละระยะของการสุกโดยวิธีการวัดความแน่นเนื้อ ตั้งแต่ในระยะที่เป็นผลดิบจนกระทั่งถึงระยะที่สุกเต็มที่พบว่าที่ความแน่นเนื้อ 210 cN สามารถสกัดไซลาเนสได้แอคติวิตีจำเพาะสูงสุดเท่ากับ 0.66 ยูนิตต่อมิลลิกรัมโปรตีน จึงได้ทำการสกัดแยกไซลาเนสอย่างหยาบจากผลกล้วยน้ำว้าที่ความแน่นเนื้อ 210 cN และทำให้บริสุทธิ์โดยการตกตะกอนโปรตีนด้วยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวที่ 80% จากนั้นผ่านคอลัมน์ซีเอ็ม-เซลลูโลสโครมาโตกราฟี และ คอลัมน์เซฟาเดกซ์จี-50 เจลฟิลเตรชันตามลำดับ ผลปรากฏว่าไซลาเนสที่ได้มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 14.7 เท่าและไม่พบแอคติวิตีของเซลลูเลส เมื่อตรวจสอบความบริสุทธิ์ของเอนไซม์ด้วยการทำเอสดีเอส-พอลิอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโทรโฟริซิส จะพบแถบโปรตีนเพียง 1 แถบ มวลโมเลกุลที่หาได้จากการทำเอสดีเอส-พอลิอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโทรโฟริซิสมีค่าเท่ากับ 19 กิโลดาลตัน ซึ่งได้ผลใกล้เคียงกับมวลโมเลกุลของไซลาเนสที่หาได้จากคอลัมน์เซฟาเดกซ์ จี-50 ซึ่งมีค่าเท่ากับ 21 กิโลดาลตัน ในการศึกษาสมบัติของเอนไซม์พบว่า ความเป็นกรด-ด่างและอุณหภูมิ ที่เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์คือ 5.5 และ 45 องศาเซลเซียสตามลำดับ ความเสถียรของเอนไซม์ต่ออุณหภูมิอยู่ในช่วง 30 – 45 องศาเซลเซียส ค่า Km ของไซลาเนสต่อไซแลนจากเปลือกข้าวโอ๊ตและไม้เบิร์ชเท่ากับ 1.28 และ 0.50 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตรตามลำดับ ที่ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ของ Hg²⁺ และ Zn²⁺ เอนไซม์จะถูกยับยั้งการทำงานได้อย่างสมบูรณ์ ส่วน Cu²⁺ , Mg²⁺ , Sn²⁺ ,Fe²⁺ และ Ca²⁺ ที่มีความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์จะสามารถยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ได้ 59.52 , 33.58 , 22.46 , 5.56 และ 2.60 เปอร์เซ็นต์ตามลำดับ ผลการดัดแปลงกรดอะมิโนของเอนไซม์ด้วยสารเคมีที่มีความจำเพาะพบว่า N-bromosuccinimide และ diethylpyrocarbonate ที่ความเข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์สามารถยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ได้ 96.4 และ 82.0 เปอร์เซ็นต์ตามลำดับ แสดงว่าทริปโตฟานและฮีสติดีนอาจจะเป็นกรดอะมิโนที่จำเป็นสำหรับการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์