Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/3342
Title: Purification and characterization of isoforms of starch branching enzyme from tuber of cassava Manihot esculenta CRANTZ
Other Titles: การทำให้บริสุทธิ์และลักษณะสมบัติของไอโซฟอร์มของเอนไซม์สร้างโซ่กิ่งในหัวมันสำปะหลัง Manihot esculenta CRANTZ
Authors: Surachai Yaiyen
Advisors: Tippaporn Limpaseni
Montri Chulavatnatol
Other author: Chulalongkorn University. Faculty of Science
Subjects: Enzymes
Manihot esculenta crantz
Cassava
Issue Date: 2003
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: Cassava starch is one of the major raw material used in many industries. Starch is composed of the polysaccharides, amylose and amylopectin, which were synthesized by a group of enzymes including starch branching enzyme (SBE). Starch branching enzyme involved amylopectin synthesis by catalyzing formation of alpha-1, 6-glucosyl-alpha-1,4-glucan. There are two classes of, class A preferentially branches amylopectin whereas class B preferentially branch amylose. In this study, starch branching enzyme was monitored in cassava tubers from two cultivars, Rayong 1 and KU 50. SBE activity rapidly increased around 9 months old. Purification and isoform studies were performed with tubers from 9 months old KU 50. The crude enzyme was purified by precipitation with 10% (w/v) polyethylene glycol, followed by DEAE-Toyopearl column which could separate SBE into 3 isoforms. Hitrap Q-sepharose column was further used to purify each isoform which resulted in purities of 125, 77 and 250. All isoform showed molecular weight of 57 kDa on Sephacryls HR S-200. Isoform 1 separated by SDS- PAGE, into 2 bands with molecular weight 108 and 57 kDa whereas isoform 2 and 3 showed single band with molecular weight of 57 and 60 kDa. The pI of the 3 isoform was 4.9, 4.9 and 5.0, respectively. Optimum pH{7f2019}s were 8.0, 6.5, 7.5 and optimum temperatures were 37, 37 and 30 ํC for isoform 1, 2 and 3, respectively. All isoforms were stable up to 40 ํC. The K[subscript m]'s for amylose were 1.12, 1.37 and 2.17 mg/ml. Isoform 1 and 2 were more active than isoform 3 towards amylose as substrate, whereas isoform 3 was more active than isoforms 1 and 2 with amylopectin as substrate. All isoforms were absolutely inhibited by divalent metal ion.
Other Abstract: มันสำปะหลังเป็นพืชเศรษฐกิจที่มีการส่งออกปริมาณสูง แป้งมันสำปะหลังสามารถนำไปใช้ประโยชน์ในอุตสาหกรรมต่างๆ เช่น ผลิตผงชูรส แอลกอฮอล์ และ กระดาษ แป้งจะประกอบด้วยอะไมโลส และ อะไมโลเพคติน เอนไซม์ที่ทำหน้าที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ อะไมโลส และ อะไมโลเพคติน ในพืชมีหลายชนิด เอนไซม์สร้างโซ่กิ่งเป็นเอนไซม์ตัวหนึ่งที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์อะไมโลเพคติน เอนไซม์สร้างโซ่กิ่งเร่งปฏิกิริยาการสังเคราะห์ alpha-1,6-glucosyl-alpha-1,4-glucan ในการวิจัยเอนไซม์สร้างโซ่กิ่งในพืช เช่น ข้าวโพด มันฝรั่ง พบว่าเอนไซม์นี้มีหลายไอโซฟอร์ม ซึ่งสามารถแบ่งได้ 2 กลุ่ม คือ กลุ่มที่จำเพาะต่อการสร้างโซ่กิ่งในอะไมโลเพคติน เรียกว่า กลุ่ม A และกลุ่ม B ที่จำเพาะต่อการสร้างโซ่กิ่งในอะไมโลส การทดลองนี้ศึกษาเอนไซม์นี้ในหัวมันสำปะหลัง โดยการเปรียบเทียบอายุของหัวมันสำปะหลัง 2 สายพันธุ์คือ Rayong 1 และ KU 50 พบว่าที่ระยะ 6-9 เดือน มีอัตราการเพิ่มขึ้นของเอนไซม์สูง จึงเลือกหัวมันอายุ 9 เดือน ของสายพันธุ์ KU 50 ซึ่งเป็นสายพันธุ์ที่มีปริมาณแป้งสูง มาทำการสกัดและแยกไอโซฟอร์มให้บริสุทธิ์ โดยการตกตะกอนโปรตีนด้วย polyethylene glycol ที่ความเข้มข้น 10% และ คอลัมน์โครมาโตกราฟีชนิดแลกเปลี่ยนไอออนคือ DEAE-Toyopearl สามารถแยกได้ 3 ไอโซฟอร์ม และทำแต่ละไอโซฟอร์มให้บริสุทธิ์เพิ่มขึ้นด้วย Hitrap Q-sepharose ไอโซฟอร์มของเอนไซม์สร้างโซ่กิ่ง ที่เตรียมได้มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น125, 77 และ 250 เท่าตามลำดับ และมีน้ำหนักโมเลกุลเมื่อวิเคราะห์ด้วย Sephacryl HR S-200 เท่ากับ 57 กิโลดาลตันทุกไอโซฟอร์ม เมื่อวิเคราะห์ต่อด้วยอิเล็กโตโฟริซีสแบบเสียสภาพพบในไอโซฟอร์มที่ 1 มีโปรตีน 2 แถบ ที่มีน้ำหนักโมเลกุล 108,000, 57,000 ดาลตัน ส่วน ไอโซฟอร์ม 2 และ 3 มีแถบโปรตีน แถบเดียว มีน้ำหนัก 57000 และ 60,000 ดาลตัน มีค่า pI เท่ากับ 4.9 4.9 และ 5.0 ตามลำดับ ไอโซฟอร์ม 1, 2 และ 3 สามารถทำปฏิกิริยาได้ดีที่ค่าความเป็นกรด-ด่าง 8.0, 6.5 และ 7.5 ที่อุณหภูมิ 37, 37 และ 30 องศาเซลเซียส ตามลำดับ มีความเสถียรที่อุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียสทุกตัว ทุกไอโซฟอร์มสามารถถูกยับยั้งด้วยไอออนของโลหะที่มีประจุเป็น +2 เอนไซม์มีค่า Km ต่อ อะไมโลส เท่ากับ 1.12 1.37 และ 2.17 มก./มล. ไอโซฟอร์ม ที่ 1 และ 2 มีความจำเพาะต่ออะไมโลสมากกว่าอะไมโลเพคติน ส่วนไอโซฟอร์มที่ 3 มีความจำเพาะต่ออะไมโลเพคตินมากกว่าอะไมโลส
Description: Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 2003
Degree Name: Master of Science
Degree Level: Master's Degree
Degree Discipline: Biochemistry
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/3342
ISBN: 9741758502
Type: Thesis
Appears in Collections:Sci - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
surachai.pdf1.09 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.