Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/39551
Title: Reversal effect of vitamin c on diabetes induced endothelial dysfunction in rats : roles of reactive oxygen species, tetrahydrobiopterin, and nitric oxide
Other Titles: ผลของวิตามินซีต่อการเปลี่ยนกลับการสูญเสียหน้าที่ของเอนโดทีเลียมที่เกิดจากการเหนี่ยวนำด้วยเบาหวานในหนูแรท : บทบาทของอนุมูลอิสระ เตตระไฮโดรไบออพเทอรินและไนตริกออกไซด์
Authors: Pattarin Sridulyakul
Advisors: Suthiluk Patumraj
Other author: Chulalongkorn University. Graduate School
Advisor's Email: suthilukp@yahoo.com
Subjects: Vitamin C -- Therapeutic use
Endothelial cells
Diabetes -- Treatment
Tetrahydrobiopterin
Nitric oxide
วิตามินซี -- การใช้รักษา
เซลล์เอนโดธีเลียม
เบาหวาน -- การรักษา
เตตระไฮโดรไบออพเทอริน
ไนตริกออกไซด์
Issue Date: 2550
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: This study aimed to examine the effects of vitamin C on reversing endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Male Spraque-Dawley rats weighing 200-250 g were divided into four groups: control (CON), diabetes (DM, using iv. injection of streptozotocin (STZ); 50 mg/kg BW), DM+Vit.C6wks, and DM+Vit.Cday2. For DM+Vit.C6wks, and DM+Vit.Cday2, they received vitamin C 1g/L on week 6th and on day 2 after STZ-injection, respectively. The diabetes-induced endothelial dysfunction was demonstrated by the impairment of mesenteric arteriolar acetylcholine (Ach)-induced vasodilation and the increase in leukocyte-endothelial cell interaction. These abnormalities were restored by delayed treatment of vitamin C (DM+Vit.C6wks) and prevented by early vitamin C supplementation (DM+Vit.Cday2). The importance of this present study was indicated that vitamin C supplementation could reverse diabetes-induced endothelial cell dysfunction in mesenteric microcirculation. Next, we aimed to examine the underlying mechanism(s) of reversal effect of vitamin C. Base on the first hypothesis, it is believed that vitamin C could restore endothelial function by its direct scavenging reactive oxygen species (ROS). In order to prove this hypothesis, therefore, we monitored hydrogen peroxide (H[subscript 2]O[subscript 2]), one stable form of ROS, by using the specific H[subscript 2]O[subscript 2] associated fluorescent dye called dihydrorhodamine 123 (DHR-123) with real time intravital fluorescence videomicroscopy. The results indicated that the H[subscript 2]O[subscript 2]-associated fluorescent intensity was greatly increased in 6wk-DM group compared to 6wk-CON. Interestingly, both vitamin C supplementation groups (DM+Vit.C6wks and DM+Vit.Cday2) have shown less H[subscript 2]O[subscript 2]-associated fluorescent intensity in the same manner. Together with this direct scavenging effect of vitamin C, therefore, we made a direct detection for nitric oxide (NO), since the idea was that NO should increase when ROS was scavenged. By using 4,5-diaminofluorescein-diacetate (DAF-2DA), the NO-associated fluorescent intensity was determined for each group; CON, DM, CON +2.6 mM Vit.C, and DM+2.6 mM Vit.C at 20-min vitamin C perfusion. The results showed that NO content was significantly decreased in 6wk-DM compared to 6wk-CON. However, vitamin C application could significantly increase NO contents in both CON and DM groups. Based on our finding, we indicated that vitamin C was able to scavenging ROS, as a consequence, it released NO. The second hypothesis for reversal effect of vitamin C was addressed by its possibly acting on preserving tetrahydrobiopterin (BH[subscript 4]) bioavailability. The experiments were conducted by dividing 6wk-CON and 6wk-DM into six groups: 1) Vehicle; 30-min Krebs-Ringer perfusion, 2) Veh+Vit.C; 1-min 2.6 mM vitamin C administration after 30-min Krebs-Ringer perfusion, 3) DAHP; 30-min BH[subscript 4] antagonist (20 mM, 2,4-diamino-6-hydroxypyrimidine (DAHP), 4) DAHP+Vit.C; 1-min 2.6 mM vitamin C administration after 30 min DAHP, 5) DAHP+BH[subscript 4]; 20-min BH[subscript 4] donor after 10-min DAHP, and 6) DAHP+BH[subscript 4]+Vit.C ; 10-min DAHP followed by 20-min BH[subscript 4] donor and 1-min vitamin C. The results indicated that the DAHP-mediated BH[subscript 4] deficiency significantly caused the reduction of Ach-induced vasodilatation in both CON and DM. Interestingly, this abnormality was improved by administration with vitamin C, or BH[subscript 4], or the combined vitamin C and BH[subscript 4]. Furthermore, the H[subscript 2]O[subscript 2]-associated fluorescent intensity was greatly increased when BH[subscript 4] synthesis was blocked by DAHP. Interestingly, this abnormality could be attenuated by the administration of vitamin C, or BH[subscript 4], or the combined vitamin C and BH[subscript 4]. Beside, it should be noted that the DAHP-induced the reduction of Ach-induced vasodilatation could be improved partially by vitamin C administration. Therefore, it may be concluded that vitamin C could regenerate BH¬[subscript 4] and consequently increase active form of coupled-eNOS. In conclusion, our results indicated that vitamin C could reverse diabetes-induced endothelial dysfunction at early stage of 6-wk diabetic induction. The possible mechanisms of vitamin C were worked through its potential on direct ROS scavenging and on enhancing BH[subscript 4] bioavailability. Therefore, it implied that vitamin C could increase NO bioavailability. And it may be used as a good therapeutic agent recommended for diabetic care.
Other Abstract: การศึกษาวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาบทบาทของการให้วิตามินซีเสริมต่อการเปลี่ยนกลับการสูญเสียหน้าที่ของเอนโดทีเลียมในภาวะเบาหวาน หนูขาวเพศผู้สายพันธุ์ เสปรย์-ดอลเลย์ น้ำหนัก 200- 250 กรัม แบ่งออกเป็น 4 กลุ่ม คือ กลุ่มควบคุม (CON) กลุ่มเบาหวาน (DMโดยวิธีฉีดสารสเตรปโตโซโตซิน (STZ) เข้าทางหลอดเลือดดำในขนาดความเข้มข้น 50 มิลลิกรัมต่อกิโลกรัมน้ำหนักตัว) กลุ่มเบาหวานที่ได้รับวิตามินซีเสริมหลังจากฉีด STZ 6 สัปดาห์ (DM+Vit.C6wks) และกลุ่มเบาหวานที่ได้รับวิตามินซีเสริมหลังจากหลังจากฉีด STZ 2 วัน (DM+Vit.Cday2) สำหรับกลุ่ม DM+Vit.C6wks และ DM+Vit.Cday2 จะได้รับวิตามินซีในขนาดความเข้มข้น 1 กรัมต่อลิตรในสัปดาห์ที่ 6 และ วันที่ 2 หลังจากฉีดสาร STZ ตามลำดับ จากนั้นทำการศึกษาการสูญเสียหน้าที่ของเอนโดทีเลียมที่เกิดจากการเหนี่ยวนำด้วยเบาหวานซึ่งจำแนกได้จากการลดลงของการตอบสนองของหลอดเลือดแดงรองในลำไส้ต่อสารอะเซทิลโคลีน (Ach) และจากการเพิ่มขึ้นของการเกาะติดของเม็ดเลือดขาวต่อเซลล์เอนโดทีเลียม ภาวะผิดปกตินี้สามารถแก้ไขได้โดยการชะลอการได้รับวิตามินซีเสริมหลังการสูญเสียหน้าที่ของเอนโดทีเลียม (DM+Vit.C6wks) และสามารถป้องกันได้โดยการได้รับวิตามินซีเสริมตั้งแต่แรกก่อนการสูญเสียหน้าที่ของเอนโดทีเลียม (DM+Vit.Cday2) ส่วนที่สำคัญจากผลการทดลองนี้ชี้ให้เห็นว่าการให้วิตามินซีเสริมสามารถเปลี่ยนกลับการสูญเสียหน้าที่ของเอนโดทีเลียมในหลอดเลือดขนาดเล็กในลำไส้ที่ถูกเหนี่ยวนำให้เป็นเบาหวานได้ หลังจากนั้นคณะผู้วิจัยมีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษากลไกการทำงานในเชิงลึกของผลของวิตามินซีต่อการเปลี่ยนกลับ สมมติฐานแรกเชื่อว่าการที่วิตามินซีสามารถเปลี่ยนกลับหน้าที่ของเอนโดทีเลียมได้เนื่องมาจากการที่วิตามินซีสามารถกำจัดอนุมูลอิสระ (ROS) ได้โดยตรง เพื่อเป็นการทดสอบสมมติฐานนี้คณะผู้วิจัยจึงทำการวัดไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H[subscript 2]O[subscript 2]) ซึ่งเป็น ROS ชนิดหนึ่งที่มีความเสถียรด้วยสารฟลูออเรสเซนต์ที่มีความจำเพาะต่อ H[subscript 2]O[subscript 2] ที่มีชื่อเรียกว่า dihydrorhodamine 123 (DHR-123) ซึ่งทำการวัดตามเวลาที่เกิดขึ้นจริงโดยใช้ intravital fluorescence videomicroscopy ผลการวิจัยพบว่าความเข้มของการเรืองแสงที่สัมพันธ์กับ H[subscript 2]O[subscript 2] เพิ่มขึ้นอย่างมากในกลุ่ม DM ที่ 6 สัปดาห์ เมื่อเทียบกับกลุ่ม CON ที่ 6 สัปดาห์ แต่เป็นที่น่าสนใจว่าทั้งสองกลุ่มที่ได้รับวิตามินซี (DM+Vit.C6wksและ DM+Vit.Cday2) แสดงการลดระดับของความเข้มของการเรืองแสงที่สัมพันธ์กับ H[subscript 2]O[subscript 2] ในระดับใกล้เคียงกัน เนื่องมาจากผลของวิตามินซีต่อการกำจัด ROS ได้โดยตรง ดังนั้นคณะผู้วิจัยจึงทำการวัดไนตริกออกไซด์ (NO) ตามเวลาที่เกิดขึ้นจริง เนื่องมาจากความคิดที่ว่า NO ควรจะเพิ่มขึ้นเมื่อ ROS ถูกกำจัด โดยการใช้สี 4,5-diaminofluorescein- diacetate (DAF-2DA) ความเข้มของการเรืองแสงที่สัมพันธ์กับ NO จะถูกวัดในแต่ละกลุ่มการทดลอง ได้แก่ กลุ่ม CON กลุ่ม DM กลุ่ม CON ที่ได้รับวิตามินซีความเข้มข้น 2.6 มิลลิโมลาร์ โดยการหยดเป็นเวลา 20 นาที (CON +2.6 mM Vit.C) และ กลุ่ม DM ที่ได้รับวิตามินซีความเข้มข้น 2.6 มิลลิโมลาร์ โดยการหยดเป็นเวลา 20 นาที (DM+2.6 mM Vit.C) ผลการศึกษาวิจัยพบว่า ปริมาณ NO ลดลงอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติในกลุ่ม DM ที่ 6 สัปดาห์ เมื่อเทียบกับ กลุ่ม CON ที่ 6 สัปดาห์ อย่างไรก็ตามการให้วิตามินซีสามารถเพิ่มปริมาณ NO อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติทั้งในกลุ่ม CON และกลุ่ม DM จากผลการทดลองนี้ชี้ให้เห็นว่าวิตามินซีสามารถกำจัด ROS ส่งผลให้ปลดปล่อย NO เพิ่มขึ้นสมมติฐานที่สองของวิตามินซีต่อการเปลี่ยนกลับเชื่อว่ามาจากการที่วิตามินซีสามารถรักษาการทำงานของเตตระไฮโดรไบออพเทอริน(BH [subscript 4]) ได้ การทดลองนี้หนูกลุ่ม CON ที่ 6 สัปดาห์ และ กลุ่ม DM ที่ 6 สัปดาห์ จะถูกแบ่งออกเป็น 6 กลุ่มย่อยคือ 1) กลุ่มเปรียบเทียบซึ่งหยด Krebs-Ringer solution 30 นาที (Vehicle) 2) กลุ่มเปรียบเทียบที่ได้รับวิตามินซีความเข้มข้น 2.6 มิลลิโมลาร์ 1 นาที หลังจากหยด Krebs-Ringer solution 30 นาที (Veh+Vit.C) 3) กลุ่มยับยั้งการสร้าง BH[subscript 4]ซึ่งหยด DAHP ความเข้มข้น 20 มิลลิโมลาร์ 30 นาที (DAHP) 4) กลุ่มยับยั้งการสร้าง BH[subscript 4]ที่ได้รับวิตามินซี 1 นาที หลังจากหยด DAHP 30 นาที (DAHP+Vit.C) 5) กลุ่มยับยั้งการสร้าง BH[subscript 4]ที่ได้รับ BH[subscript 4] 20 นาที หลังจากหยด DAHP 10 นาที (DAHP+BH[subscript 4]) และ 6) กลุ่มยับยั้งการสร้าง BH[subscript 4]ซึ่งหยด BH[subscript 4] 20 นาที ตามด้วยวิตามินซี 1 นาที หลังจากหยด DAHP 10 นาที (DAHP+BH[subscript 4]+Vit.C) ผลการศึกษาวิจัยพบว่าภาวะพร่อง BH[subscript 4] ที่เกิดจากการใช้สาร DAHP ทำให้เกิดการลดลงของการขยายตัวของหลอดเลือดต่อ Ach ทั้งในกลุ่ม CON และ กลุ่ม DM แต่เป็นที่น่าสนใจว่าการเปลี่ยนแปลงที่ผิดปกติดังกล่าวสามารถแก้ไขได้โดยการให้วิตามินซี การให้ BH[subscript 4] และ การให้วิตามินซีร่วมกับ BH[subscript 4] นอกจากนั้นยังพบว่าความเข้มของการเรืองแสงที่สัมพันธ์กับ H[subscript 2]O[subscript 2] เพิ่มขึ้นอย่างมากเมื่อมีการยับยั้งการสร้าง BH[subscript 4] โดยการใช้สาร DAHP แต่เป็นที่น่าสนใจมากว่าการเปลี่ยนแปลงที่ผิดปกตินี้สามารถลดลงได้โดยการให้วิตามินซี การให้ BH[subscript 4] และ การให้วิตามินซีร่วมกับ BH[subscript 4] นอกจากนี้ควรที่จะให้ความสำคัญถึงผลของการให้วิตามินซีที่สามารถแก้ไขความผิดปกติของการลดลงของการขยายตัวของหลอดเลือดต่อ Ach ที่เกิดจากการใช้สาร DAHP ดังนั้นอาจจะสรุปได้ว่าวิตามินซีมีความสามารถเพิ่มการสร้าง BH[subscript 4] ขึ้นใหม่ส่งผลให้กระตุ้นการทำงานของเอนไซม์เอนโดทีเลียมไนตริกออกไซด์ซินเทสที่อยู่ในรูปแบบที่เอื้อต่อการสร้าง NOโดยสรุปจากผลการศึกษาแสดงให้เห็นว่าวิตามินซีสามารถเปลี่ยนกลับการสูญเสียหน้าที่ของเอนโดทีเลียมที่เกิดจากภาวะเบาหวานระยะเริ่มต้น ที่ 6 สัปดาห์ โดยผ่านทางกลไกการทำงานของวิตามินซีในการกำจัด ROS อย่างมีประสิทธิภาพ และความสามารถในการเพิ่มการทำงานของ BH[subscript 4] ดังนั้นกล่าวได้ว่าวิตามินซีสามารถเพิ่มการทำงานของ NO และวิตามินซีอาจนำมาใช้ในการดูแลผู้ป่วยเบาหวานในฐานะเป็นสารที่ใช้ในการรักษาได้
Description: Thesis (Ph.D.)--Chulalongkorn University, 2007
Degree Name: Doctor of Philosophy
Degree Level: Doctoral Degree
Degree Discipline: Physiology (Inter-Department)
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/39551
Type: Thesis
Appears in Collections:Grad - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Pattarin_Sr.pdf9.38 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.