Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/40980
Title: Development of Nuclear Transfer and Embryonic Stem Cell Technology in Mouse
Other Titles: การพัฒนาเทคโนโลยีการย้ายฝากนิวเคลียสและเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนในหนู
Authors: Ruttachuk Rungsiwiwut
Advisors: Mongkol Techakumphu
Pramuan Virutamasen
Dinnyes, Andres
Other author: Chulalongkorn University. Faculty of Veterinary Science
Advisor's Email: mongkol.t@chula.ac.th
No information provided
No information provided
Subjects: Stem cells
Embryonic stem cells
สเต็มเซลล์
สเต็มเซลล์ตัวอ่อน
ปริญญาดุษฎีบัณฑิต
Issue Date: 2007
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: The objectives of this study were to compare the efficiency of embryonic stem cells (ESCs) derived from fertilized blastocysts of different mouse strains (EXP. 1), to compare the efficiency of ESCs derivation and characterization of ESCs derived from cloned and fertilized blastocysts (EXP. 2) and to compare the potential of in vitro differentiation of ESCs derived from cloned and fertilized blastocysts (EXP. 3). EXP 1. The strains of mouse used in this experiment were C57BL/6 (inbred), B6D2F1 (hybrid) and CD1(outbred). Firstly, 40-44 expanded blastocysts developed in vivo were collected and subjected to ICM number evaluation. Secondly, Pou5fl positive cells were detected in 10-14 expanded blastocyts. Thirdly, Efficiency of ESC derivation from different mouse strains was compared. Expanded blastocysts of inbred showed no significant difference in ICM number compared to hybrid but significantly higher than outbred. The Pou5f1 positive cells were detected in all blastocysts of three examined strains. No significant difference of efficiency in ESCs derived from expanded blastocysts of inbred (16.7%) and hybrid strain (31.6%) but no ESC line was obtained from the outbred strain. Finally in additional experiments, delayed blastocysts of outbred strain were used to evaluate ICM number, detect Pou5fl and establish ESC line. Delayed blastocyst of outbred showed significantly higher ICM number than expanded blastocysts of the same strain. Pou5fl was detected in delayed blastocysts and outbred ESC lines can be derived from delayed blastocysts. This finding indicated that efficiency of ESC derived from expanded blastocysts of inbred and hybrid strain was not different regarded to no difference of ICM number. Outbred ESC lines can be derived from delayed blastocysts but not expanded blastocysts. EXP 2. Cloned and fertilized blastocysts were subjected to Pou5fl positive cells detection. Efficiency of ESC derived from cloned and fertilized blastocysts were compared. Pluripotency of ESCs derived from cloned and fertilized blastocysts were detected by specific markers and gene expression of ESCs. Pou5fl positive cells were detected in cloned (10/10) and fertilized blastocysts (10/10). Efficiency of ESCs derived from cloned [15.4%; 4/26)] was significantly lower than fertilized blastocysts [62.5%; 15/24]. ESCs derived from cloned displayed specific markers, gene expression and normal chromosome number similar to those derived from fertilized blastocysts. This study indicated that although Pou5fl positive cells were detected in cloned as in fertilized blastocysts, the efficiency of ESC derivation of the former was inferior. By detecting specific markers, gene expression and chromosome number, ESCs derived from cloned and fertilized blastocysts display similarity. EXP 3. Nuclear transfer-derived ESCs (NT-ESCs) and fertilization-derived ESCs (F-ESCs) derived EBs were produced in hanging drops, cultured in suspension and in vitro differentiation potential were compared. Mean of diameter of EBs were measured every 3-4 day up to Day 26. Histomorphology and gene expression were investigated in 1, 2, 3, 4 and 5-week-old EBs. EBs formation efficiency of NT-ESCs did not significantly differ from F-ESCs (95% vs 96.8% respectively). NT-ESCs derived EBs showed significantly greater diameter than F-ESCs derived EBs in Day 7 and 10. Primitive neural tubes were found in NT-ESCs and F-ESCs derived EBs at Day 14. Expression pattern of AFP in NT-ESCs and F-ESCs derived EBs was different. This study showed some differences between NT-ESCs and F-ESCs derived EBs which will be useful for further study of comparative characteristics of NT-ESCs and F-ESCs.
Other Abstract: การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อ เปรียบเทียบประสิทธิภาพการสร้างเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนหนูเมาส์ จากตัวอ่อนที่เกิดจากการปฏิสนธิของหนูต่างสายพันธุ์ เปรียบเทียบประสิทธิภาพของการสร้างเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนและคุณลักษณะของเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนที่เกิดจากการปฏิสนธิและการย้ายฝากนิวเคลียส เปรียบเทียบการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ที่ทำหน้าที่จำเพาะระหว่างเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนที่สร้างจากตัวอ่อนที่เกิดจากการปฏิสนธิและการย้ายฝากนิวเคลียส โดยแบ่งออกเป็น 3 การทดลอง การทดลองที่ 1 ใช้หนูเมาส์ 3 สายพันธุ์ อินบริด (inbred), ไฮบริด (hybrid) และเอาท์บริด (outbred) เก็บตัวอ่อนที่ปฏิสนธิภายในร่างกายระยะเอกซแพนบลาสโตซิส (expanded blastocyst) จำนวน 40-44 ตัวอ่อนจากแต่ละสายพันธุ์ เปรียบเทียบจำนวนอินเนอร์เซลล์แมส (inner cell mass) ในบลาสโตซิส เก็บตัวอ่อนจำนวน 10-15 ตัวอ่อนจากแต่ละสายพันธุ์ตรวจหาเซลล์ที่ให้ผลบวกต่อยีน Pou5fl ในตัวอ่อนจากหนูทั้งสามสายพันธุ์ ผลการศึกษาพบว่าจำนวนอินเนอร์เซลล์แมสในตัวอ่อนระยะแอกซแพนบลาสโตซิสของหนูสายพันธุ์อินบริดไม่แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ กับสายพันธุ์ไฮบริด แต่มากกว่าสายพันธุ์เอาท์บริดอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ตรวจพบเซลล์ที่ให้ผลบวกต่อยีน Pou5fl ในตัวอ่อนทุกสายพันธุ์ ประสิทธิภาพการสร้างเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนจากตัวอ่อนระยะแอกซแพนบลาสโตซิสของหนูสายพันธุ์อินบริด (16.7%) เท่ากับไฮบริด (31.6%) ไม่สามารถสร้างได้จากสายพันธุ์เอาท์บริด ทดสอบเพิ่มเติมเฉพาะกับสายพันธุ์เอาท์บริดโดยใช้ตัวอ่อนระยะดีเลย์บลาสโตซิส (delayed blastocyst) พบว่า มีจำนวนอินเนอร์เซลล์แมสมากกว่าอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติเมื่อเปรียบเทียบกับตัวอ่อนระยะแอกซแพนบลาสโตซิสในสายพันธุ์เดียวกัน ตรวจพบเซลล์ที่ให้ผลบวกต่อยีน Pou5fl และสามารถสร้างเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนจากสายพันธุ์เอาท์บริดได้ สรุปว่าประสิทธิภาพการสร้างเซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อนระยะแอกซแพนบลาสโตซิสของสายพันธุ์อินบริดและไฮบริดไม่ต่างกันเพราะจำนวนอินเนอร์เซลล์แมสไม่ต่างกัน ระยะของตัวอ่อนที่เหมาะสมที่จะใช้สร้างเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนจากสายพันธุ์เอาท์บริดคือระยะดีเลย์บลาสโตซิส การทดลองที่ 2 ตรวจหาเซลล์ที่ให้ผลบวกต่อยีน Pou5fl ในตัวอ่อนระยะบลาสโตซีสที่เกิดจากการย้ายฝากนิวเคลียสและจากการปฏิสนธิอย่างละ 10 ตัวอ่อน เปรียบเทียบประสิทธิภาพการสร้างเซลล์ต้นกำเนิดต้วอ่อนและคุณลักษณะของการเป็นเซลล์ต้นกำเนิดที่สร้างจากตัวอ่อนทั้งสองชนิดในระดับเซลล์และการแสดงออกของยีนบางยีน ผลการศึกษาพบว่าสามารถตรวจพบเซลล์ที่ให้ผลบวกต่อยีน Pou5fl ทั้งในตัวอ่อนที่เกิดจากการย้ายฝากนิวเคลียสและจากการปฏิสนธิ ประสิทธิภาพการสร้างเซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อนที่เกิดจากการย้ายฝากนิวเคลียสเท่ากับ 15.4% (4/26) ต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติเมื่อเปรียบเทียบกับตัวอ่อนที่เกิดจากการปฏิสนธิ 62.5% (15/24) เซลล์ต้นกำเนิดที่สร้างจากตัวอ่อนที่เกิดจากการย้ายฝากนิวเคลียสแสดงคุณลักษณะของการเป็นเซลล์ต้นกำเนิดและมีจำนวนโครโมโซมที่ปกติเช่นเดียวกับเซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อนที่เกิดจากการปฏิสนธิ สรุปว่าแม้ตัวอ่อนระยะบลาสโตซีสที่เกิดจากการย้ายฝากนิวเคลียสจะมีเซลล์ที่ให้ผลบวกต่อยีน Pou5fl เช่นเดียวกับที่เกิดจากการปฏิสนธิ แต่ประสิทธิการสร้างเซลล์ต้นกำเนิดยังต่ำกว่า เซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อนที่เกิดจากการย้ายฝากนิวเคลียสแสดงคุณลักษณะของการเป็นเซลล์ต้นกำเนิดในระดับเซลล์และการแสดงออกของยีนจำเพาะบางยีนคล้ายกับเซลล์ต้นกำเนิดจากตัวอ่อนที่เกิดจากการปฏิสนธิ การทดลองที่ 3 เปรียบเทียบการเปลี่ยนแปลงเป็นเซลล์ที่ทำหน้าที่จำเพาะระหว่างเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนที่สร้างจากการย้ายฝากนิวเคลียสและจากการปฏิสนธิโดยศึกษาใน embryoid bodies (EBs) สร้าง EBs จากเซลล์ต้นกำเนิด เลี้ยงแบบแขวนลอย วัดขนาดทุก 3-4 วันจนถึงวันที่ 26 เก็บ EBs ในสัปดาห์ที่ 1, 2, 3, 4 และ 5 เพื่อตรวจการลักษณะทางจุลกายวิภาคและ การแสดงออกของยีน พบว่าประสิทธิภาพการพัฒนาเป็น EBs ระหว่างเซลล์ต้นกำเนิดสร้างจากการย้ายฝากนิวเคลียสและจากการปฏิสนธิไม่แตกต่างกันทางสถิติ (95% และ 96.8% ตามลำดับ) เส้นผ่าศูนย์กลาง EBs จากเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนจากการย้ายฝากนิวเคสียสมีขนาดใหญ่กว่าจากการปฏิสนธิอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติในสัปดาห์ที่ 2 และ 3 พบโครงสร้างระยะแรกของท่อระบบประสาทในสัปดาห์ที่สองของ EBs จากเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนทั้งสองชนิด มีความแตกต่างของการแสดงออกของยีน AFP ใน EBs ที่สร้างจากเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนจากการย้ายฝากนิวเคสียสและเซลล์ต้นเนิดตัวอ่อนจากการปฏิสนธิ ความแตกต่างระหว่างเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนที่สร้างจากการย้ายฝากนิวเคลียสและจากการปฏิสนธิที่ได้จากการศึกษานี้จะเป็นพื้นฐานในการศึกษาเชิงเปรียบเทียบระหว่างเซลล์ต้นกำเนิดตัวอ่อนทั้งสองชนิดต่อไป
Description: Thesis (Ph.D.)--Chulalongkorn University, 2007
Degree Name: Doctor of Philosophy
Degree Level: Doctoral Degree
Degree Discipline: Theriogenology
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/40980
URI: http://doi.org/10.14457/CU.the.2007.1796
metadata.dc.identifier.DOI: 10.14457/CU.the.2007.1796
Type: Thesis
Appears in Collections:Vet - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Ruttachuk_Ru.pdf1.99 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.