Cloning and expression of dehydroquinate dehydratase, shikimate dehydrogenase and glucose dehydrogenase genes from Cluconobacter oxydans 621H

Abstract

ซิคิเมตและดีไฮโดรซิคิเมต ถูกนำมาใช้เป็นวัตถุดิบตั้งต้นเพื่อผลิตสารในอุตสาหกรรมหลายประเภทอย่างกว้างขวาง ยังผลให้เกิดการศึกษาและการพัฒนากระบวนการผลิตของสารดังกล่าว ในการศึกษานี้ได้ทำการโคลนยีนดีไฮโดรควิเนตดีไฮดราเตส (dqd, GOX0437) และยีนซิคิเมตดีไฮโดรจีเนส (skdh GOX0859 และ GOX1959) จากเชื้อกลูโคโนแบคเตอร์สายพันธุ์ 621H และทำการแสดงออกที่มากเกินปกติในเชื้ออีโคไลสายพันธุ์ BL21 (DE3) โดยใช้ pET-21a เป็นเวคเตอร์แสดงออก จากผลการแสดงออกของ E. coli BL21 (DE3)/pET-dqd พบว่า เมื่อทำการแสดงออกที่ 30 องศาเซลเซียส เอนไซม์มีแอคติวิตี (10.80 หน่วยต่อมิลิกรัม) สูงกว่าเมื่อทำการแสดงออกที่ 37 องศาเซลเซียส 4 เท่า สำหรับการแสดงออกของ skdh (GOX0859) ค่าแอคติวิตีของ E. coli BL21(DE3)/pET-GOX0859 มีค่าต่ำ (0.048 หน่วยต่อมิลลิกรัม) และไม่แตกต่างจากเชื้ออีโคไลสายพันธุ์ BL21(DE3) ดังนั้นยีน skdh (GOX0859) จึงถูกโคลนเข้าเวคเตอร์แสดงออก pCold I และแสดงออกร่วมกับ chaperone vector (pG-KJE8) เพื่อปรับปรุงแอคติวิตีของเอนไซม์ SKDH ซึ่งจากผลการแสดงออกร่วมกันพบว่ายีน skdh (GOX0859) ไม่มีแอคติวิตีของเอนไซม์ SKDH ในทางกลับกันการแสดงออกของ E. coli BL21 (DE3)/pET-GOX1959 เอนไซม์ SKDH มีแอคติวิตีสูงขึ้นอย่างเห็นได้ชัด (92.49 หน่วยต่อมิลลิกรัม) เมื่อใช้ซิคิเมตและ NADP+ เป็นสับสเตรทและโคแฟตเตอร์ตามลำดับ การแสดงออกนี้ทำให้เอนไซม์ SKDH มีแอคติวิตีสูงขึ้นจากเดิม 15 เท่า ดังนั้นจึงได้ทำเอนไซม์ SKDH (GOX1959) ให้บริสุทธิ์ด้วย Ni-NTA agarose คอลัมน์เพื่อหาค่าจลนพลศาสตร์โดยค่า Km และค่า Vmax สำหรับซิคิเมตและ NADP+ มีค่าเท่ากับ 250 ไมโครโมลาร์, 168.4 ไมโครโมลต่อนาทีมิลลิกรัมโปรตีน และ 51.7 ไมโครโมลาร์, 384.6 ไมโครโมลต่อนาทีมิลลิกรัมโปรตีน ตามลำดับ ยีน skdh (GOX1959) ได้ถูกแสดงออกในเชื้อกลูโคโนแบคเตอร์สายพันธุ์ IFO3244 โดยใช้ pSG8 เป็นเวคเตอร์แสดงออกส่งผลให้แอคติวิตีของเอนไซม์ SKDH มีค่าสูงขึ้น 10 เท่า นอกจากนี้มีการนำ NADP+ กลับมาใช้อีกครั้งโดยทำการแสดงออกร่วมกันของ ยีน gdh (GOX2015) ซึ่งถอดรหัสให้เอนไซม์กลูโคสดีไฮโดรจีนเนสและยีน skdh (GOX1959) ในเวคเตอร์ pET-21a ภาวะที่เหมาะสมในการแสดงออกยีนทั้งสองนี้ร่วมกัน คือ เลี้ยงในอาหาร LB ปริมาตร 100 มิลลิลิตร ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส และเหนี่ยวนำให้เกิดการแสดงออกด้วย 0.2 มิลลิโมลาร์ IPTG เพื่อที่จะปรับปรุงแอคติวิตีของเอนไซม์ GDH ให้สูงขึ้น ซึ่งให้แอคติวิตีของ SKDH (GOX0859) และ GDH สูงถึง 279.24 หน่วยต่อมิลลิกรัม และ 1.03 หน่วยต่อมิลลิกรัม อย่างไรก็ตามเมื่อนำ pET-GOX1959 มาแสดงออกร่วมกับเวคเตอร์ pACGD ซึ่งมียีน gdh จากเชื้อบาซิลัส สายพันธุ์ megaterium ในเชื้ออีโคไลสายพันธุ์ BL21(DE3) ไม่ได้ช่วยเพิ่มแอคติวิตีของ GDH