Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/43636
Title: GLYCINE UPTAKE AND CHARACTERIZATION OF GLYCINE TRANSPORTER IN HALOTOLERANT CYANOBACTERIUM Aphanothece halophytica
Other Titles: การนำเข้าไกลซีนและลักษณะสมบัติของตัวขนส่งไกลซีนในไซยาโนแบคทีเรียทนเค็ม Aphanothece halophytica
Authors: Aporn Bualuang
Advisors: Aran Incharoensakdi
Teruhiro Takabe
Other author: Chulalongkorn University. Faculty of Science
Advisor's Email: aran.i@chula.ac.th
No information provided
Subjects: Biochemistry
Amino acids -- Analysis
Gene expression
ชีวเคมี
กรดอะมิโน -- การวิเคราะห์
การแสดงออกของยีน
ปริญญาดุษฎีบัณฑิต
Issue Date: 2013
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: This study on glycine uptake by alkaliphilic halotolerant cyanobacterium Aphanothece halophytica comprised two parts. The first part dealt with biochemical characterization of the uptake whereas the second part involved molecular characterization. Cells were grown under various concentrations of NaCl from 2.5-3.0 M. Increasing NaCl concentration reduced cell growth due to salt stress effect. Supplementation of glycine up to 40 mM enhanced the growth of A. halophytica under normal condition (0.5 M NaCl). Similarly, under salt stress condition (2.0 M NaCl), the addition of up to 20 mM glycine could reverse the effect of growth inhibition by salt stress. However, too high concentration of glycine (at 100 mM under normal condition, and 60 mM under salt stress condition) led to the complete inhibition of cell growth. The uptake of glycine in A. halophytica was monitored. A. halophytica grown for 8 days showed the highest glycine uptake rate. The uptake rate of A. halophytica exhibited saturation kinetics according to Michaelis-Menten kinetic parameters with an apparent Km of 160.80 µM and Vmax of 3.85 nmol/min/mg protein. The optimal pH for glycine transport was at pH 8.0. Both of dissipating ion inhibitors and metabolic inhibitors inhibited glycine uptake in A. halophytica. The results of uptake experiment suggested that there might be at least two systems of glycine transporter with regard to energy supply. Based on shot gun sequence, A. halophytica contained a gene homolog of alanine glycine cation symporter (ApagcS1). The ApagcS1 gene contains 1443 bp, encoding 480 amino acid residues. The prediction of deduced amino acid residue by transmembrane prediction program TMHTMM Server v.2 showed ApAgcS1 consisting of 10 transmembrane segments. ApagcS1 was cloned and characterized in E. coli JW4166 (deficient in glycine transport) cells. The JW4166 transformant cell harboring an pApagcS1 required Na+ for glycine uptake. ApAgcS1 showed kinetic parameters with an apparent Km for glycine of 12.53 µM and the Vmax value was 35.74 nmol/min/mg protein. Substrate specificity of ApAgcS1 showed broad specificity for amino acid transport with optimum activity at pH 9.0. Cells of Synechococcus sp. PCC 7942 ∆natG mutant harboring pSyn1_ApagcS1 vector showed a reduction in the accumulation of amino acid in the medium with serine, asparagine, glutamine and isoleucine showing a significant reduction (p<0.05) when compared to Synechococcus sp. PCC 7942 ∆natG mutant harboring an empty vector. The level of mRNA for ApagcS1 in A. halophytica cell was induced by NaCl and nitrogen deficiency stresses with up to 2-fold and 3-fold respectively after 3 h NaCl stress and 1 h without nitrate.
Other Abstract: ในงานวิจัยครั้งนี้ศึกษาเกี่ยวกับการนำเข้ากรดอะมิโนไกลซีนในไซยาโนแบคทีเรียทนเค็ม Aphanothece halophytica แบ่งออกเป็นสองส่วน โดยส่วนแรกศึกษาเกี่ยวกับการตรวจสอบคุณลักษณะทางชีวเคมีของการนำเข้าไกลซีน และส่วนที่สองเกี่ยวกับลักษณะสมบัติของยีนตัวขนส่งกรดอะมิโนไกลซีน เลี้ยงเซลล์ในภาวะที่มีความเข้มข้นของเกลือตั้งแต่ 0.25 ถึง 3.0 โมลาร์ ความเข้มข้นของเกลือมากขึ้นส่งผลให้การเจริญของเซลล์ลดลงเนื่องมาจากภาวะเครียดจากเกลือ การเติมกรดอะมิโนไกลซีนความเข้มข้นจนถึง 40 มิลลิโมลาร์ช่วยส่งเสริมการเจริญของเซลล์ในภาวะปกติที่มีความเข้มข้นของเกลือโซเดียมคลอไรด์ (0.5 โมลาร์) การเติมกรดอะมิโนไกลซีนความเข้มข้นจนถึง 20 มิลลิโมลาร์ ภายใต้ภาวะเครียดที่มีความเข้มข้นของเกลือโซเดียมคลอไรด์ (2.0 โมลาร์) ช่วยให้การเจริญกลับคืนมาเหมือนการเจริญในภาวะปกติ อย่างไรก็ตามการเติมไกลซีนที่ความเข้มข้นสูงมากเกินไปส่งผลให้เกิดการยับยั้งการเจริญของเซลล์โดยที่ความเข้มข้นของไกลซีน 100 และ 60 มิลลิโมลาร์ยับยั้งการเจริญในภาวะปกติและภาวะเครียดจากเกลือตามลำดับ การศึกษาการนำเข้ากรดอะมิโนไกลซีนในเซลล์ของ A. halophytica พบว่าอายุของเซลล์ที่เจริญมาแปดวันให้ผลการนำเข้าดีที่สุด โดยแสดงค่าอิ่มตัวคงที่ของ มิเคลลิส เมนเทนเท่ากับ 160.80 ไมโครโมลาร์ และมีค่าความเร็วสูงสุดเท่ากับ 3.85 นาโนโมลต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน ค่าความเป็นกรดด่างที่ให้ผลการนำเข้าไกลซีนสูงสุดคือที่ 8.0 การนำเข้าไกลซีนถูกยับยั้งจากทั้งตัวยับยั้งพลังงานและตัวยับยั้งที่ทำลายเกรเดียนต์ของไอออน ซึ่งจากผลของตัวยับยั้งดังกล่าวอาจจะกล่าวได้ว่าการนำเข้าไกลซีนมีด้วยกันสองระบบที่เกี่ยวข้องกับการใช้พลังงาน จากข้อมูลการทำ shot gun sequence พบว่าใน A. halophytica มียีนตัวขนส่งอะลานีนหรือไกลซีนร่วมกับแคทไอออน (ApagcS1) ซึ่งยีนนี้มีขนาด 1443 คู่เบส ประกอบด้วยกรดอะมิโน 480 เรซิดิว จากการนำลำดับกรดอะมิโนไปวิเคราะห์ด้วย TMHTMM Server v.2 พบว่าประกอบด้วย 10 ทรานสเมมเบรน โดยยีน ApagcS1 ถูกนำมาโคลนและศึกษาลักษณะสมบัติในเซลล์ E. coli JW4166 สายพันธุ์กลายที่ถูกทำลายยีนการขนส่งตัวไกลซีน พบว่า ApAgcS1 ต้องการ โซเดียมไอออนในการขนส่งไกลซีน โดยมีค่าอิ่มตัวคงที่ของ มิเคลลิส เมนเทนเท่ากับ 12.53 ไมโครโมลาร์ และมีค่าความเร็วสูงสุดเท่ากับ 35.74 นาโนโมลต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน การนำเข้าไกลซีนถูกยับยั้งด้วยกรดอะมิโนหลายชนิดซึ่งอาจบอกได้ว่ามีความจำเพาะต่อการนำเข้ากรดอะมิโนได้หลายชนิด การนำเข้าไกลซีนโดย ApAgcS1 เกิดได้ดีที่ภาวะเป็นกรดด่างเท่ากับ 9.0 เมื่อนำยีน ApagcS1 เข้าไปในไซยาโนแบคทีเรีย Synechococcus sp. PCC 7942 ∆natG (สายพันธุ์กลายที่ถูกทำลายระบบขนส่งอะมิโนที่ไม่มีประจุ) โดยศึกษาผลการสะสมกรดอะมิโนในอาหาร พบว่ามีการสะสมของกรดอะมิโนซีรีน แอสปาราจีน กลูตามีน และไอโซลิวซีน ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (p<0.05)เมื่อเปรียบเทียบกับ Synechococcus sp. PCC 7942 ∆natG การแสดงออกของยีน ApagcS1 ใน A. halophytica พบว่ามีการแสดงออกเพิ่มขึ้น 2 และ 3 เท่า หลังจากการทำให้อยู่ในภาวะเครียดจากเกลือและขาดไนโตรเจน 3 และ 1 ชั่วโมงตามลำดับ
Description: Thesis (Ph.D.)--Chulalongkorn University, 2013
Degree Name: Doctor of Philosophy
Degree Level: Doctoral Degree
Degree Discipline: Biochemistry
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/43636
URI: http://doi.org/10.14457/CU.the.2013.1072
metadata.dc.identifier.DOI: 10.14457/CU.the.2013.1072
Type: Thesis
Appears in Collections:Sci - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
5273889223.pdf4.13 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.