Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/45461
Title: การพัฒนาวิธีที่รวดเร็วในการตรวจเชื้อ Helicobacter pylori ที่ดื้อยา คลาริโธรมัยซิน ด้วยเทคนิค Loop-mediated isothermal amplification ร่วมกับการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ
Other Titles: DEVELOPMENT OF RAPID CLARITHROMYCIN RESISTANT Helicobacter pylori STRAINS DETECTION BY LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION COMBINED WITH RESTRICTION ENDONUCLEASE DIGESTION
Authors: ธนภร จำปาไทย
Advisors: นันทรี ชัยชนะวงศาโรจน์
Other author: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะสหเวชศาสตร์
Advisor's Email: Nuntaree.C@Chula.ac.th,nuntaree@gmail.com,Nuntaree.C@Chula.ac.th
Issue Date: 2557
Publisher: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
Abstract: ยาคลาริโธรมัยซิน เป็นยาปฏิชีวนะหลักของการรักษามาตรฐานแบบ Triple therapy ที่ใช้รักษาการติดเชื้อ Helicobacter pylori ซึ่งในปัจจุบันพบว่ามีปัญหาการดื้อยาคลาริโธรมัยซินเพิ่มสูงขึ้นและทำให้การรักษาล้มเหลว กลไกการดื้อยาเกิดจากการกลายพันธุ์ในบริเวณ peptidyltransferase ของ domain V ของ ยีน 23S rRNA พบว่าการกลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง A2143G มีความสัมพันธ์กับการดื้อยาอย่างมีนัยสำคัญและเป็นตำแหน่งกลายพันธุ์ที่มีอุบัติการณ์สูงในหลายประเทศ งานวิจัยนี้จึงได้พัฒนาเทคนิคการตรวจวิเคราะห์เชื้อ H. pylori ที่ดื้อยาคลาริโธรมัยซิน ที่มีการกลายพันธุ์ยีน 23S rRNA ตำแหน่ง A2143G ด้วยเทคนิค Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) ร่วมกับการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ (LAMP-RFLP) โดยทำการตรวจยืนยันเชื้อ H. pylori จากตัวอย่าง urease test ที่ให้ผลบวกด้วยเทคนิค PCR และตรวจการกลายพันธุ์ของ 23S rRNA ที่ตำแหน่ง A2143G ด้วยวิธี PCR –RFLP ทำการออกแบบไพรเมอร์ LAMP ของยีน 23S rRNA และ ทดสอบสภาวะที่เหมาะสม ผลพบว่าตัวอย่าง urease test ที่ให้ผลบวกจำนวน 353 ตัวอย่าง มีเชื้อ H. pylori จำนวน 101 ตัวอย่าง และมีตัวอย่างที่กลายพันธุ์ยีน 23S rRNA ตำแหน่ง A2143G คิดเป็น 7.5 เปอร์เซ็นต์ (4/53) ผลวิเคราะห์ลำดับเบสของเชื้อ H. pylori 29 สายพันธุ์ พบการกลายพันธุ์ของ 23S rRNA ตำแหน่ง A2142G, A2143G, T2182C และ A2143G+T2182C คิดเป็น 3.4, 3.4, 48.3 และ 10.3 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ สภาวะที่เหมาะสมของปฏิกิริยา LAMP ในการเพิ่มปริมาณยีน 23S rRNA ของเชื้อ H. pylori จะใช้ความเข้มข้นของสารต่างๆ ดังนี้ ไพรเมอร์ FIP/ BIP เป็น 1.6 ไมโครโมลาร์ F3/B3 เป็น 0.2 ไมโครโมลาร์ และ LF/LB เป็น 0.8 ไมโครโมลาร์ เบตาอีนเป็น 0.8 โมลาร์ ดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์ไตรฟอสเฟต เป็น 1.4 มิลลิโมลาร์ แมกนีเซียมซัลเฟต เป็น 0.6 โมลาร์ บ่มที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 60 นาที นำผลผลิต LAMP ตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ BsaI พบว่าสามารถแยกระหว่าง wild type และ mutant type ได้สำเร็จ โดย wild type จะเห็นลักษณะสเมียร์แบนแบบขั้นบันได ขณะที่ A2143G mutant type จะเห็นแถบดีเอ็นเอ 3 ขนาด คือ 92, 103 และ 250 bp ดังนั้นเทคนิค LAMP-RFLP ที่พัฒนาขึ้นน่าจะเป็นวิธีที่ง่ายและรวดเร็วสำหรับตรวจการกลายพันธุ์ยีน 23S rRNA ตำแหน่ง A2143G ของเชื้อ H. pylori ซึ่งสามารถนำไปใช้ประโยชน์ในการตรวจคัดกรองการดื้อยาคลาริโธรมัยซินจากตัวอย่างเชื้อ H. pylori ที่แยกได้จากผู้ป่วยในประเทศที่มีอัตราการดื้อยาสูงเพื่อเลือกใช้ยาปฏิชีวนะที่เหมาะสมได้
Other Abstract: Clarithromycin is the key antibiotic of standard triple therapy to treat Helicobacter pylori infection. The problem of clarithromycin resistance has been dramatically increased nowadays which contributed to eradication failure. The mechanism of clarithromycin resistance is due to mutation in the peptidyltransferase region of domain V of the 23S rRNA. Mutation at the position A2143G significantly correlated to antibiotic resistance and found high prevalence in many countries. In this study, LAMP based assay with restriction enzyme analysis (LAMP-RFLP) was developed for determination of A2143G mutations in 23S rRNA associated with clarithromycin resistance of H. pylori. PCR amplification was used for the confirmation of H. pylori identification in positive urease test samples and PCR-RFLP method was performed to detect an A2143G point mutation in 23S rRNA. LAMP primers of 23S rRNA were designed and tested for optimal conditions. Of all 353 positive urease test samples, 101 could be amplified for H. pylori gene and 7.5% (4/53) were mutated at A2143G of 23S rRNA gene. Sequencing results of 23S rRNA among the 29 strains of H. pylori found the mutations at position A2142G 3.4%, A2143G 3.4%, T2182C 48.3% and A2143G+T2182C 10.3%. The optimal conditions for LAMP amplification of H. pylori 23S rRNA contained 0.2 µM each of F3 and B3, 1.6 µM each of FIP and BIP, 0.8 µM each of LF and LB, 0.8 M betaine, 1.4 mM of deoxynucleoside triphosphates and 6 mM MgSO4, incubated at 65°C for 60 min. The restriction enzyme analysis of LAMP products with BsaI could successfully distinguished wild type and mutant type with the ladder like pattern in wild type and three different sizes of 92 bp, 103 bp and 250 bp in A2143G mutant type. Therefore, our LAMP-RFLP assay should be a rapid and simple method for the detection of A2143G mutation in 23S rRNA gene of H. pylori which will be useful for primary clarithromycin resistance screening of H. pylori isolated from patients in countries with a high prevalence of clarithromycin resistance for appropriate antibiotic treatment.
Description: วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2557
Degree Name: วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต
Degree Level: ปริญญาโท
Degree Discipline: วิทยาศาสตร์ระดับโมเลกุลทางจุลชีววิทยาทางการแพทย์และวิทยาภูมิคุ้มกัน
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/45461
Type: Thesis
Appears in Collections:All - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
5476653137.pdf4.83 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.