Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/54898
Title: Expression and bifunctional characterization of Plasmodium falciparum orotidine 5′-monophosphate decarboxylase/orotate phosphoribosyltransferase fused enzyme
Other Titles: การแสดงออกและคุณลักษณะสองหน้าที่ของเอนไซม์ออโรทิดีน 5′-โมโนฟอสเฟต ดีคาร์บอกซีลเลสและออโรเทต ฟอสฟอไรโบซิลทรานสเฟอเรส ที่เชื่อมต่อกัน ในเชื้อพลาสโมเดียม ฟัลซิพารัม
Authors: Patsarawadee Paojinda
Advisors: Jerapan Krungkrai
Sudaratana Krungkrai
Other author: Chulalongkorn University. Graduate School
Advisor's Email: Jerapan.K@Chula.ac.th,jerapan.k@chula.ac.th
sudykk@yahoo.co.th
Issue Date: 2016
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: Fusion of the last two enzymes in the pyrimidine biosynthetic pathway in the inversed order by having a COOH-terminal orotate phosphoribosyltransferase (OPRT) and an NH2-terminal orotidine 5'-monophosphate decarboxylase (OMPDC), as OMPDC-OPRT, are described in some organisms. Here, we produced gene fusions of Plasmodium falciparum OMPDC-OPRT, and expressed as the bifunctional enzyme in Escherichia coli. The enzyme was purified to near homogeneity using affinity and anion-exchange chromatography, exhibited enzymatic activities and functioned as a dimer. The enzymatic activities, although unstable, were stabilized by its substrate and product during purification and long-term storage. Furthermore, the enzyme expressed a perfect catalytic efficiency (kcat/Km). The turnover number (kcat) was selectively enhanced up to three orders of magnitude, while the Michaelis constant (Km) was not much affected and remained at low µM levels, when compared to the enzymes in the monofunctional and in the complex forms, as published earlier. The fusion of the two enzymes, creating a “super-enzyme” with perfect catalytic power and more flexibility, reflects cryptic relationship of enzymatic reactivities and metabolic functions on molecular evolution.
Other Abstract: การเชื่อมต่อกันของเอนไซม์สองลำดับสุดท้ายในกระบวนการสังเคราะห์ไพริมิดีน ซึ่งมีลักษณะการเรียงแบบกลับกัน โดยเอนไซม์ออโรเทต ฟอสฟอไรโบซิลทรานสเฟอเรส อยู่ด้านหมู่คาร์บอกซิลิก และ เอนไซม์ออโรทิดีน 5′-โมโนฟอสเฟต ดีคาร์บอกซีลเลส อยู่ด้านหมู่อะมิโน (ออโรทิดีน 5′-โมโนฟอสเฟต ดีคาร์บอกซีลเลส-ออโรเทต ฟอสฟอไรโบซิลทรานสเฟอเรส) ที่พบในสิ่งมีชีวิตหลายชนิด การศึกษาครั้งนี้เราได้ทำการผลิตยีนที่เชื่อมต่อกัน แบบออโรทิดีน 5′-โมโนฟอสเฟต ดีคาร์บอกซีลเลส-ออโรเทต ฟอสฟอไรโบซิลทรานสเฟอเรสในเชื้อพลาสโมเดียม ฟัลซิพารัมและทำการแสดงออกของโปรตีนสองหน้าที่ในเชื้อเอสเชอริเชีย โคไล หลังจากนั้นได้ทำให้เอนไซม์มีความบริสุทธิ์เกือบเป็นเนื้อเดียวกันโดยใช้แอฟฟินิตีโครมาโตกราฟี และแอนไอออนเอ็กซ์เชนจ์โครมาโตกราฟี โดยพบว่าเอนไซม์มีการทำงานในรูปของโมเลกุลคู่สองหน่วยพื้นฐานที่เหมือนกัน ถึงแม้ว่าการทำงานของเอนไซม์จะไม่เสถียรภาพแต่สามารถทำให้เก็บรักษาเอนไซม์ได้เป็นระยะเวลาที่นานขึ้นโดยการใส่สารตั้งต้น และผลิตภัณฑ์ของเอนไซม์ ในระหว่างขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ นอกจากนี้เอนไซม์ยังแสดงออกถึงประสิทธิภาพการเร่งปฎิกิริยาของเอนไซม์ที่สมบูรณ์ (kcat/Km) โดยการศึกษาครั้งนี้พบว่ามีผลต่อค่าจำนวนการกลับมาทำปฎิกิริยาซ้ำ (kcat) มากถึง 1,000 เท่า ในขณะที่ไม่ได้กระทบต่อค่าคงที่ของ Michaelis (Km) มากนักโดยอยู่ในระดับไมโครโมลาร์ เมื่อเปรียบเทียบกับเอนไซม์ในรูปแบบการทำงานเดี่ยว และแบบจับกันเป็นคอมเพล็กซ์ที่ตีพิมพ์เผยแพร่มาก่อนนี้ การเชื่อมต่อกันของทั้งสองเอนไซม์อยู่บนโปรตีนเดียวกันเป็นการสร้าง "ซุปเปอร์เอนไซม์" ที่มีประสิทธิภาพในการเร่งปฏิกิริยาที่สมบูรณ์ และความยืดหยุ่นของเอนไซม์ แสดงถึงความสัมพันธ์ในการวิวัฒนาการระดับโมเลกุลของปฏิกิริยาเอนไซม์ และการทำงานของเมแทบอลิซึม
Description: Thesis (Ph.D.)--Chulalongkorn University, 2016
Degree Name: Doctor of Philosophy
Degree Level: Doctoral Degree
Degree Discipline: Biomedical Sciences
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/54898
Type: Thesis
Appears in Collections:Grad - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
5587829220.pdf5.51 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.