Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/56172
Title: CHARACTERIZATION OF RECOMBINANT AMYLOMALTASE FROM Thermus filiformis JCM 11600 AND STABILITY IMPROVEMENT BY SITE-DIRECTED MUTAGENESIS
Other Titles: ลักษณะสมบัติของรีคอมบิแนนต์แอมิโลมอลเทสจาก Thermus filiformis JCM 11600 และการปรับปรุงความเสถียรโดยวิธีกลายเฉพาะตำแหน่ง
Authors: Piriya Kaewpathomsri
Advisors: Piamsook Pongsawasdi
Kuakarun Krusong
Shuichiro Murakami
Other author: Chulalongkorn University. Faculty of Science
Advisor's Email: Piamsook.P@Chula.ac.th,piamsook.p@gmail.com,Piamsook.p@chula.ac.th
Kuakarun.K@Chula.ac.th
smura@isc.meiji.ac.jp
Issue Date: 2014
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: Amylomaltase (EC 2.4.1.25) catalyzes the α-1,4 glycosyl transfer within or between the glucan molecules to produce cyclic large-ring cyclodextrins (LR-CDs) or linear oligosaccharides/glycosides, respectively. The amylomaltase gene from Thermus filiformis JCM11600 (TfAM) was cloned and the sequence consisted of 1,458 bps. The gene was expressed in Escherichia coli BL21(DE3), then the enzyme was purified. TfAM encoded the polypeptide of 485 amino acid residues, the shortest among Thermus amylomaltases, with a 70 % sequence identity to amylomaltases from other Thermus and a calculated molecular mass of 55.47 kDa and pI of 5.11. Highest disproportionation activity occurred with maltotriose substrate at pH 6.5 and 60 °C to produce linear oligosaccharides. However, highest cyclization activity was observed at pH 5.0 and 70 °C, resulting in large-ring cyclodextrins with CD22 as the smallest and CD24-CD29 as principle products. Although TfAM had optimum condition at high temperature, the enzyme still lost 80% of its disproportionation activity after incubation for 2 hrs at pH 9.0 or 1 hr at 90 °C. Site-directed mutagenesis at Glu27 was chosen in the attempt to improve enzyme stability. Substitution of E27 by R, Q, F and V was performed. Characterization of mutated enzymes revealed two interesting mutants, E27F with a change in substrate specificity from G3 to G5 and E27R with a higher alkaline and thermo- stability as compared to WT-TfAM. E27R forms an Arg cluster (R27-R30-R31-R34) on the enzyme surface, showed a significant increase in stability at extreme pH and temperature and a shift towards higher pH and temperature optima in cyclization reaction. Conformational change of E27R at pH 9.0 and temperature above 350 K was observed through the circular dichroism spectra and the thermal transition profiles.
Other Abstract: แอมิโลมอลเทส (EC 2.4.1.25) เป็นเอนไซม์ที่เร่งปฏิกิริยาโยกย้ายหมู่ไกลโคซิลภายในหรือระหว่างสายกลูแคน ทำให้เกิดผลิตภํณฑ์ไซโคลเดกซ์ทรินวงใหญ่หรือออลิโกแซ็กคาไรด์สายตรง/กลูโคไซด์ตามลำดับ เราได้โคลนยีนแอมิโลมอลเทส จาก Thermus filiformis JCM 11600 (TfAM) พบว่า มี ORF ขนาด 1,458 คู่เบส แล้วทำการแสดงออกยีนใน Escherchia coli BL21 (DE3) และทำเอนไซม์ให้บริสุทธิ์ ยีน amylomaltase นั้นถอดรหัสเป็นกรดอะมิโนได้ 485 ตัว ซึ่งสั้นกว่าแอมิโลมอลเทสอื่นในจีนัส Thermus และมีความเหมือนของลำดับกรดอะมิโนประมาณ 70 % โดยคำนวณน้ำหนักโมเลกุลและ ค่า pI ได้เท่ากับ 55.47 กิโลดาลตัน และ 5.11 ตามลำดับ มีภาวะเหมาะสมที่สุดในการทำปฏิกิริยา disproportionation ซึ่งผลิตออลิโกแซ็กคาไรด์สายตรงโดยใช้ มอลโทไทรโอสเป็นสารตั้งต้น ที่ 60 °ซ และ pH 6.5 แต่ภาวะเหมาะสมในปฏิกิริยา cyclization คือ 70 °ซ และ pH 5.0 ทำใหัเกิดไซโคลเดกซ์ทรินวงใหญ่ที่มีขนาดต่ำสุดคือ CD22 โดยผลิตภัณฑ์หลักเป็น CD24-CD29 ถึงแม้ว่า TfAM จะมีภาวะเหมาะสมที่อุณหภูมิสูง แต่ยังคงสูญเสียความสามารถในการทำปฏิกิริยา disproportionation ไปกว่า 80% เมื่ออยู่ในสภาวะด่างที่ pH 9.0 เป็นเวลา 2 ชั่วโมง หรือ ที่ 90 °ซ เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ดังนั้นเทคนิคการกลายเฉพาะตำแหน่งจึงถูกเลือกใช้เพื่อปรับปรุงความเสถียรของ เอนไซม์ โดยทำการกลายในตำแหน่ง Glu27 ให้เป็น R, Q, F และV จากการตรวจสอบลักษณะสมบัติของเอนไซม์กลาย พบว่า มี 2 ตัวที่น่าสนใจ คิอ E27F ที่มีการเปลี่ยนความจำเพาะต่อซับสเทรตจาก G3 เป็น G5 และ E27R ที่ทนด่างและอุณหภูมิสูงเมื่อเทียบกับเอนไซม์ดั้งเดิม เอนไซม์กลาย E27R รวมอยู่ในกลุ่มอาร์จินีนคลัสเตอร์ R27-R30-R31-R34 ที่บริเวณพื้นผิวของเอนไซม์ ทำให้ทนต่อภาวะด่างและอุณหภูมิสูงๆมากเพิ่มขึ้น และเกิดการเปลี่ยน pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมของปฏิกิริยา cyclization ให้สูงขึ้น โดยเมื่อทำการตรวจสอบโครงรูปที่ pH 9.0 ด้วยวิธี circular dichroism และรุปแบบการเปลี่ยนความร้อนที่อุณหภูมิสูงกว่า 350 K พบว่า มีการเปลี่ยนแปลงเมื่อเทียบกับเอนไซม์ดั้งเดิม
Description: Thesis (Ph.D.)--Chulalongkorn University, 2014
Degree Name: Doctor of Philosophy
Degree Level: Doctoral Degree
Degree Discipline: Biochemistry
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/56172
Type: Thesis
Appears in Collections:Sci - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
5072620323.pdf5.2 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.