Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/61505
Title: ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY OF PEPTIDE FROM CHICKEN FEATHER MEAL IN MACROPHAGE RAW 264.7
Other Titles: ฤทธิ์ต้านการอักเสบของเพปไทด์จากขนไก่ป่นในเซลล์เพาะเลี้ยงแมคโครฟาจ RAW 264.7
Authors: Romteera Sukaboon
Advisors: Aphichart Karnchanatat
Other author: Chulalongkorn University. Faculty of Science
Issue Date: 2016
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: Inflammation is a defense mechanism in the body induced by foreign chemicals or pathogens. Thus, inflammation is one of the most critical factors implicated in vasodilation, carcinogenesis and other degenerative disorders. However, the study of the anti-inflammatory mechanism of peptides has been limited. So studies on anti-inflammatory peptides from natural sources are increasing in interest. The objective of this study, to investigate the optimal condition of enzymatic hydrolysis to prepare an anti-inflammatory peptide from chicken feather meal by using 3 types of microbial protease (Alcalase®, Flavourzyme®, and Neutrase®) in various concentrations (1% 2.5% and 5%). Peptide hydrolysate with 1% Flavourzyme® produced the best results for inhibition of NO production (IC50 5.48±1.0 µg/ml) when compared with other proteases. These peptide fractions were fractionated by ultrafiltration with 10, 5, 3 and 0.65 kDa membranes and further analyzed for NO scavenging activity. Among the fractions, MW ≤ 0.65 kDa exhibited a high level of antioxidant activity toward the NO radical scavenging assay. The ≤ 0.65 kDa fractions were selected for further fractionation by gel filtration chromatography. The F2 fraction was the strongest in inhibiting nitric oxide production. After that, F2 fraction was selected to study the NO production and cytotoxicity test by MTT assay in LPS-stimulated macrophage RAW 264.7. The result shows that the peptide also inhibited NO production and wasn’t toxic to macrophage RAW 264.7. The peptide fraction was further purified by HPLC and identification by mass spectrometry with amino acid sequence characterized into 4 peptides. In addition, the peptides are suppressed in the expression mRNA of iNOS, COX-2, IL-6 and TNF-α which are responsible for pro-inflammatory cytokine production. The results indicate that bioactive peptide from chicken feather meal can be developed to medical, pharmaceutical and cosmetic products.  
Other Abstract: กระบวนการอักเสบเป็นกระบวนตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันในร่างกายที่สำคัญต่อสิ่งกระตุ้นหรือสารที่อันตราย ซึ่งทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของหลอดเลือด และยังนำไปสู่โรคต่างๆ เช่นโรคมะเร็ง โรคอัลไซเมอร์ และ โรคหัวใจ เป็นต้น อย่างไรก็ตามในปัจจุบันงานวิจัยที่เกี่ยวข้องกับการศึกษากลไกการออกฤทธิ์ต้านการอักเสบของเพปไทด์ยังมีไม่มากนัก ดังนั้นการศึกษาฤทธิ์ต้านการอักเสบของเพปไทด์จากธรรมชาติจึงเป็นสิ่งที่น่าสนใจ โดยงานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการเตรียมเพปไทด์จากขนไก่ป่นที่มีฤทธิ์ต้านการอักเสบในเซลล์ Macrophage RAW 264.7 โดยใช้เอนไซม์โปรติเอสจากจุลินทรีย์ (อัลคาเลส ฟลาโวไซม์ และนิวเตรส) ความเข้มข้นตั้งแต่ 1% 2.5% และ 5%  แล้วทำการทดสอบฤทธิ์ขจัดอนุมูลอิสระด้วยวิธีไนตริกออกไซด์ จากผลการศึกษาพบว่าเพปไทด์ที่ได้จากการย่อยด้วยเอนไซม์ฟลาโวไซม์เข้มข้น 1% แสดงค่าการยับยั้งการสร้างอนุมูลอิสระด้วยวิธีไนตริกออกไซด์ได้ดีที่สุดเมื่อเทียบกับเอนไซม์ตัวอื่นๆ โดยแสดงค่าความเข้มข้นต่ำสุดที่สามารถยับยั้งได้ร้อยละ 50 (IC50) เท่ากับ 5.48± 1.0 µg/ml คัดแยกเพปไทด์ตามขนาดโมเลกุลด้วยเทคนิคอัลตราฟิลเตรชัน 10 5 3 และ 0.65 กิโลดาลตันตามลำดับ พบว่าเพปไทด์ที่มีขนาดโมเลกุลต่ำกว่า 0.65 กิโลดาลตัน มีฤทธิ์ในการขจัดอนุมูลอิสระไนตริกออกไซด์ได้ดีที่สุด แล้วทำบริสุทธิ์โดยเทคนิคโครมาโตกราฟี และทำการตรวจสอบความเป็นพิษของเพปไทด์จากขนไก่ป่นด้วยวิธี MTT Assay และตรวจสอบผลการยับยั้งการสร้างไนตริกออกไซด์ในเซลล์ Macrophage 264.7 ที่ถูกกระตุ้นด้วยสารไลโปโพลิแซคคาไรด์ พบว่าเพปไทด์จากขนไก่ป่นไม่มีความเป็นพิษต่อเซลล์และมีฤทธิ์ในการยับยั้งการสร้างไนตริกออกไซด์ จากนั้นนำเพปไทด์ไปทำบริสุทธิ์ด้วยเทคนิคโครมาโตกราฟีของเหลวสมรรถนะสูงและนำเพปไทด์ที่ได้ไปพิสูจน์เอกลักษณ์ด้วยเทคนิคแมสสเปกโตรเมตรีพบเพปไทด์ทั้งหมด 5 สาย นอกจากนี้เพปไทด์จากขนไก่ป่นยังได้ทำการศึกษาผลการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวของกับการอักเสบ พบว่าเพปไทด์จากขนไก่ป่นมีฤทธิ์ในการยับยั้งการแสดงออกของยีน inducible nitric oxide synthase (iNOS) Cyclooxygenase-2 (COX-2) Interleukin-6 (IL-6) และ Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) ภายในเซลล์แมคโครฟาจ RAW 264.7 ด้วย จากผลการศึกษาดังกล่าวแสดงให้เห็นว่าฤทธิ์ต้านการอักเสบของเพปไทด์จากขนไก่ป่นสามารถนำไปประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรมทางการแพทย์ เภสัชกรรมและผลิตภัณฑ์เครื่องสำอางต่อไป
Description: Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 2016
Degree Name: Master of Science
Degree Level: Master's Degree
Degree Discipline: Biotechnology
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/61505
Type: Thesis
Appears in Collections:FACULTY OF SCIENCE

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
5772114823.pdf2.44 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.