การโคลนยีนจากเชื้อ Pseydomonas pseudomallei สู่ Escherichia coli และคัดเลือกโคลนที่แสดงคุณสมบัติสลายเม็ดเลือดแดง

Abstract

Pseudomonas pseudomallei เป็นแบคทีเรียแกรมลบที่เป็นสาเหตุของโรค melioidosis คุณสมบัติที่คาดว่าน่าจะมีบทบาทในการก่อโรค ได้แก่ surface antigens และ extracellular substances พวก exotoxin, protease และ hemolysin เพื่อที่จะศึกษา hemolysin ของ P.pseudomallei ได้ใช้ recombinant DNA technique โคลนดีเอ็นเอของ P. pseudomallei สายพันธุ์ K1/88 เข้าสู่ E. coli JM 109 โดยตัดดีเอ็นเอของ P.pseudomallei ด้วย PstI อย่างไม่สมบูรณ์แล้วนำมา ligate กับพลาสมิด pUC18 ซึ่งถูกตัดด้วย PstI และถูก dephosphorylated จากนั้น transform ligation mixture สู่ competent E. coli JM 109 แล้วเพาะเลี้ยงบน amplicillin agar ที่มี X-gal เลือกโคโลนีสีขาว ซึ่งเป็นโคโลนีของ transformants ที่มี recombinant plasmids นำ transformants ไปทดสอบหา hemolytic activity ด้วย cellophane plate technique พบ transformants ที่ให้ hemolytic activity 3 โคลน ซึ่งมี recombinant plasmids ที่ให้ชื่อว่า pWC3, pWC7 และ pWD1 โดยมี inserted DNA ขนาดประมาณ 0.9, 0.9 และ 5.6 kb ตามลำดับ เมื่อใช้ inserted DNA ทั้งสามเป็น probe ในการไฮบริไดซ์กับ Southern blots พบว่า inserted DNA สามารถไฮบริไดซ์กับ Chromosomal DNA fragment ของ P. pseudomallei ที่ตัดด้วย PstI ที่ตำแหน่งเดียวกัน inserted DNA ยกเว้นกรณี inserted DNA fragment ขนาด 400 bp ของ pWC7 ที่ไฮบริไดซ์เป็น smear กับ DNA ที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูง นอกจากนี้ยังพบว่า inserted DNA ของทั้ง 3 โคลน ไม่มี homology กัน