Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/8572
Title: ผลของสภาวะการเลี้ยงโอโอไซต์ต่อการปฏิสนธินอกร่างกายของลูกโคก่อนวัยเจริญพันธุ์ : รายงานผลการวิจัย
Other Titles: Effect of in vitro culture condition of prepubertal calf oocyte on in vitro fertilization
Authors: มงคล เตชะกำพุ
นวเพ็ญ ภูติกนิษฐ์
วันเพ็ญ อดุลยานุภาพ
จินดา สิงห์ลอ
Email: mongkol.t@chula.ac.th
nawapen.p@chula.ac.th
ไม่มีข้อมูล
ไม่มีข้อมูล
Other author: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะสัตวแพทยศาสตร์
จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะสัตวแพทยศาสตร์
จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะสัตวแพทยศาสตร์
จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะสัตวแพทยศาสตร์
Subjects: โค
โอโอไซต์
ปฏิสนธิในหลอดแก้ว
Issue Date: 2546
Publisher: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
Abstract: วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้ เพื่อศึกษาศักยภาพของรังไข่ลูกโคก่อนวัยเจริญพันธุ์ด้านการตอบสนองต่อการกระตุ้นการเจริญของฟอลลิเคิลหลายใบด้วยฮอร์โมนโกนาโดโทรปินจากภายนอก และศึกษาความเหมาะสมของสภาพการเพาะเลี้ยงโอโอไซต์ของลูกโคภายนอกร่างกาย รวมถึงศึกษาความเหมาะสมของระบบเพาะเลี้ยงตัวอ่อนที่ได้จากการปฏิสนธินอกร่างกายของโอโอไซต์ของลูกโคจนถึงระยะพร้อมนำไปย้ายฝาก โดยทำการทดลองในลูกโค 3 ชุด คือ ลูกโคนมพันธุ์โฮสไตน์ ฟรีเชี่ยนจำนวน 9 ตัว ลูกโคนมพันธุ์ผสม จำนวน 9 ตัว และลูกโคไทยพื้นเมืองจำนวน 8 ตัว อายุระหว่าง 6-12 เดือน โปรแกรมการกระตุ้นรังไข่มี 2 โปรแกรม โปรแกรมแรกใช้กับลูกโคชุดที่หนึ่งและสอง ทำการฝังฮอร์โมนโปรเจสเตอโรนที่ใต้ผิวหนังหลังใบหูนาน 7 วันก่อนเริ่มให้ฮอร์โมนชนิด ฟอลลิเคิล สติมูเลติ่ง ฮอร์โมนขนาด 120-180 มิลลิกรัมต่อตัว ร่วมกับโกนาโดโทรปิน รีลิสซิ่ง ฮอร์โมนในขนาด 100 ไมโครกรัมต่อตัว โปรแกรมที่สองใช้กับลูกโคชุดที่สาม ใช้ฮอร์โมนชนิดฟอลลิเคิล สติมูเลทิ่ง ฮอร์โมน ในขนาด 120 มิลลิกรัมต่อตัวเพียงอย่างเดียว เปิดผ่าช่องท้องลูกโคเพื่อดึงรังไข่ขึ้นมานับจำนวนฟอลลิเคิลภายหลังเสร็จสิ้นการให้ฮอร์โมนแล้ว 24 ชั่วโมง พบว่าจำนวนฟอลลิเคิลบนรังไข่มีการแปรปรวนไปในระหว่างลูกโคแต่ละตัว (8-121 ฟอลลิเคิลในลูกโคชุดแรก, 13-99 ฟอลลิเคิลในลูกโคชุดที่สอง และ 23-75 ฟอลลิเคิลในลูกโคชุดที่สาม) เส้นผ่านศูนย์กลางของฟอลลิเคิลที่พบบนรังไข่ลูกโคชุดที่หนึ่ง สอง และ สาม เท่ากับ 0.51+-0.24,0.64+-0.28 และ 0.54+-0.20 เซนติเมตร ตามลำดับ พบว่าฟอลลิเคิลบนรังไข่ของลูกโคชุดที่สองมีขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางเฉลี่ยมากกว่าลูกโคชุดแรกและชุดที่สองอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ อัตราการเก็บโอโอไซต์ได้จากการเจาะเก็บด้วยวิธีใช้เข็มฉีดยาต่อกับกระบอกฉีดยาเจาะดูดจากฟอลลิเคิลโดยตรงเท่ากับ 24.5% ซึ่งต่ำกว่าการเจาะด้วยการใช้เข็มต่อกับเครื่องดูดสุญญากาศที่แรงดูด 120 มิลลิเมตรปรอทที่เก็บได้ 59.6% และการตัดรังไข่ออกทั้งสองข้างแล้วนำไปเจาะดูดโอโอไซต์ในห้องปฏิบัติการที่เก็บได้ 56.3% อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ชนิดของโอโอไซต์ที่เจาะเก็บได้โดยรวม เป็นโอโอไซต์ที่มีเซลล์คิวมูลัสหุ้มหนาแน่น 33.4% มีเซลล์คิวมูลัสหุ้มเพียงชั้นเดียวหรือบางส่วน 31.8% เซลล์คิวมูลัสแผ่กระจาย 30.5% ไม่มีเซลล์คิวมูลัสหุ้ม 2.3% และเป็นโอโอไซต์ที่เสื่อมสลาย 2.0% วิธีการเจาะเก็บโอโอไซต์มีผลต่อชนิดของโอโอไซต์ที่ได้ การใช้เข็มฉีดยาเจาะดูดโอโอไซต์จากฟอลลิเคิลโดยตรงจะได้โอโอไซต์ชนิดที่มีเซลล์คิวมูลัสแผ่กระจายมากที่สุด (41.8%) เช่นเดียวกับการเจาะเก็บโอโอไซต์จากรังไข่ที่ถูกตัดออกจากตัวสัตว์แล้ว (36.7%) การใช้เครื่องดูดสุญญากาศที่แรงดูด 120 มิลลิเมตรปรอท จะได้โอโอไซต์ชนิดที่มีเซลล์คิวมูลัสหุ้มหนาแน่นมากที่สุด (42.5%) โอโอไซต์ที่มีเซลล์คิวมูลัสแผ่กระจาย 29.4% มีโครโมโซมในระยะพร้อมปฏิสนธิทันทีที่เจาะเก็บได้ และมีอัตราการเสื่อมสลายของโครโมโซมเพิ่มขึ้นเมื่อทำการเพาะเลี้ยงนานเกินกว่า 2 ชั่วโมง ส่วนโอโอไซต์ที่ยังไม่พร้อมปฏิสนธิมีอัตราการพัฒนาสู่ระยะพร้อมปฏิสนธิสูงสุดเมื่อเพาะเลี้ยงนาน 28 ชั่วโมง (24.2%) เมื่อเปรียบเทียบการพัฒนาระหว่างโอโอไซต์จากลูกโคกับโคโตเต็มวัยพบว่า โอโอไซต์จากโคโตเต็มวัยมีการพัฒนาเร็วกว่าโอโอไซต์ที่ได้จากลูกโคในชั่วโมงที่ 8 และ 16 ของการเพาะเลี้ยง เมื่อนำมาปฏิสนธินอกร่างกายพบว่าโอโอไซต์สามารถเกิดการปฏิสนธิและแบ่งตัวได้โดยทดลองเลี้ยงในน้ำยาเพาะเลี้ยงชนิด TCM 199 ที่เติมซีรั่ม 20% และน้ำยาเพาะเลี้ยงชนิด B2 ที่เลี้ยงร่วมกับเซลล์ VERO (37.4%กับ 34.6%) แต่ไม่มีตัวอ่อนพัฒนาถึงระยะมอรูล่าหรือบลาสโตซิส จากการทดลองแสดงให้เห็นว่าสามารถกระตุ้นรังไข่ของลูกโคก่อนวัยเจริญพันธุ์ และเลี้ยงให้พร้อมปฏิสนธิได้ แต่อัตราการปฏิสนธิได้ แต่อัตราการปฏิสนธิค่อนข้างต่ำและตัวอ่อนไม่สามารถพัฒนาได้ถึงระยะที่เหมาะสมในการย้ายฝากในโคตัวรับ
Other Abstract: The objectives of this study were to evaluate the ovarian responses to gonadotropin treatment in prepubertal calves and the suitable condition for in vitro maturation and embryo culture after in vitro fertilization of the calf oocytes. Two ovarian superstimulation programs were tested. The first program was carried out in crossbred dairy (n=9) and crossbred native calves (n=8). The calves received progesterone ear implant, 7 days before starting gonadotronpin treatment. The calves were treated with 120-180 mg Follicle Stimulating Hormone (FSH), together with 100 [mu]g Gonadotropin Releasing Hormone (GnRH). The second program was used in Thai native calves (n=9). The calves received only 120 mg FSH without progesterone and GnRH. All calves underwent surgery 24 hr after the last hormone injection, the ovaries were examined and the follicles were counted and measured after laparotomy. The number of follicles varied greatly among calves (8-121 follicles per animal in crossbred dairy calves, 13-99 follicles per animal in crossbred native calves and 23-75 follicles per animal in Thai native calves). The average diameter of the follicles were 0.51 +-0.24, 0.64+-0.28 and 0.54+-0.20 cm in crossbred dairy, crossbred native and Thai native groups respectively. The oocyte recovery rate was evaluated among three collecting methods; a) manual aspiration from follicles using 19 G needle attached to a syringe, b) aspiration using vacuum pump at 120 mmHg and c) the ovaries were removed and the follicles were aspirated in the laboratory room. Method a) provided the lowest recovery rate (24.5%) compared with method b) (59.6%) and c) (56.3%). The recovered oocytes were classified based on their cumulus appearance. The percentage was 33.4%, 31.8%, 30.5%, 2.3% and 2.0% for the compact layered cumulus, single and partial layered cumulus, expand cumulus, denude and degenerated oocytes respectively. The occutes collected by method a) were mostly expanded cumulus oocytes (41.8%) as well as of those collected by method c) (36.7%), whereas method b) provided the highest compacted cumulus oocytes (42.5%). The chromosomal stage of the oocytes was examined after rapid staining. Almost 30% of the expanded cumulus oocytes showed the chromosome of matured stage at the time of collection. The appropriate culture time in vitro for this group should not exceed 2 hours. The immature oocytes cultures for 28 hours showed the highest percentage of maturation (24.2%). The oocytes from adult cows could develop faster than those from calves after being cultured in vitro for 8 and 16 hours. Two culture systems using for embryo culture after in vitro fertilization were compared. The embryo cultured in TCM199 plus 20% FCS had slightly higher cleavage rate than those cultured in B2 medium with VERO cell line (37.4% vs 34.6%), but none reached morula or blastocyst stage. In conclusion, it was possible to stimulate the ovary of prepubertal calf and the oocytes are able to be matured and fertilized in vitro. However, the in vitro embryo culture systems used here did not support the embryo development to transferable stage; morula or blastocyst stage.
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/8572
Type: Technical Report
Appears in Collections:Vet - Research Reports

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
mongkol_vit.pdf19.45 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.