Please use this identifier to cite or link to this item: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/9474
Title: Accumulation of glycine betaine and partial purification of betaine aldehyde dehydrogenase from a halotolerant cyanobacterium aphanothece halophytica
Other Titles: การสะสมไกลซีนบีเทนและการทำให้บริสุทธิ์บางส่วน ของเอนไซม์บีเทนอัลดีฮายด์ดีไฮโดรจีเนส จากไซยาโนแบคทีเรียสายพันธุ์ทนเค็ม Aphanothece halophytica
Authors: Uthaiwon Kumarb
Advisors: Aran Incharoensakdi
Other author: Chulalongkorn University. Graduate School
Advisor's Email: iaran@sc.chula.ac.th
Subjects: Glycine
Cyanobacteria
Aldehyde dehydrogenase
Issue Date: 1997
Publisher: Chulalongkorn University
Abstract: The H1-NMR spectroscopy was a suitable method for the determination of glycine betaine in a halotolerant cyanobacterium, A.halophytica. The amount of glycine betaine from A.halophytica was 9.7 nmol/10 6 cells when the cells were grown in non-salt stressed condition (0.5M NaCl). Glycine betaine accumulation increased up to 8 folds when A.halophytica cells were cultivated in salt stressed condition (2M NaCl). Betaine aldehyde dehydrogenase was purified about 18-fold from A.halophytica with a specific activity of 290.8 micro mol min -1mg-1. The procedure included fractional precipitation with 35-70% ammonium sulfate and DEAE-cellulose column chromatography. The optimum condition for betaine aldehyde dehydrogenase activity was pH 7.5 and 25 ํC. The A.halophytica betaine aldehyde dehydrogenase was specific for betaine aldehyde and NAD+ with a Km of 91 and 71.4 micro M respectively. The Vmax of betaine aldehyde dehydrogenase was 175.4 micro mol min -1mg-1. The acetaldehyde and ethanolamine as substrate analogs showed strong inhibition towards betaine aldehyde dehydrogenase activity. NaCl and KCl at or below 0.1 M stimulated BADH activity. At higher than 0.1 M KCl the enzyme activity declined and returned to the control level whereas for higher than 0.1 M NaCl the enzyme activity was inhibited. CaCl2 and MgCl2 at all concentrations tested up to 0.5 M inhibited betaine aldehyde dehydrogenase activity. The p-chloromercuriphenyl sulfonic acid was a potent inhibitor of the enzyme. Preincubation of the enzyme with DTT could protect the enzyme activity against the inhibition by p-chloromercuriphenyl sulfonic acid. Gel filtration and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis suggested that the molecular weight of the enzyme was 120,000 dalton and it was likely that the enzyme was a tetramer of 30,000 dalton subunits. The relationship between salt stress and betaine aldehyde dehydrogenase activity revealed that the high external salinity increased specific activity of betaine aldehyde dehydrogenase. The data supported the idea that the synthesis of betaine aldehyde dehydrogenase could be induced by external salinization.
Other Abstract: วิธี H1-NMR มีความเหมาะสมสำหรับการวัดปริมาณสารประกอบไกลซีนบีเทน ในไซยาโนแบคทีเรียสายพันธุ์ทนเค็ม A.halophytica และพบว่า ปริมาณสารไกลซีนบีเทนในเซลล์ A.halophytica ที่เลี้ยงในอาหารภาวะปกติ (0.5M NaCl) เท่ากับ 9.7 นาโนโมลต่อ 10 6 เซลล์ และเซลล์ตอบสนองต่อภาวะที่ความเข้มข้น ของเกลือในอาหารเลี้ยงสูงขึ้น (2M NaCl) โดยการสะสมสารไกลซีนบีเทนเพิ่มขึ้น 8 เท่า การเตรียมเอนไซม์บีเทนอัลดีฮายด์ดีไฮโดรจีเนส จากไซยาโนแบคทีเรียสายพันธุ์ทนเค็ม A.halophytica ให้บริสุทธิ์โดยผ่านการตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟต ที่มีความเข้มข้นอิ่มตัว 35-70 เปอร์เซนต์และโครมาโตกราฟฟีแบบ ดี อี เอ อี-เซลลูโลส ได้เอนไซม์ที่มีแอคติวิตีจำเพาะเท่ากับ 290.8 ไมโครโมลต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน และมีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้นประมาณ 18 เท่า pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมต่อการทำงานของ เอนไซม์บีเทนอัลดีฮายด์ดีไฮโดรจีเนสจาก A.halophytica คือที่ pH 7.5 และที่อุณภูมิ 25 องศาเซลเซียส ในการศึกษาทางจลนศาสตร์ของเอนไซม์พบว่า เอนไซม์มีความเหมาะต่อ สับสเตรท บีเทนอัลดีฮายด์ และโคเอนไซม์ NAD+ โดยมีค่าคงที่มิเคลิส (Km) เท่ากับ 91 และ 71.4 ไมโครโมลาร์ ตามลำดับ และมีค่าความเร็วสูงสุด เท่ากับ 175.4 ไมโครโมลต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน อะเซตทาลดีฮายด์ และเอทธาโนลามีน ซึ่งเป็นสารที่มีโครงสร้างคล้ายสับสเตรท มีผลยับยั้งการทำงานของเอนไซม์อย่างมาก การศึกษาผลของเกลือต่อการทำงานของเอนไซม์พบว่า ที่ความเข้มข้นของเกลือ NaCl และ KCl เท่ากับหรือน้อยกว่า 0.1 โมลาร์ มีผลกระตุ้นให้การทำงานของเอนไซม์ดีขึ้น เมื่อความเข้มข้นของ KCl สูงกว่า 0.1 โมลาร์ การทำงานของเอนไซม์จะลดน้อยลงและจะคืนสู่ระดับปรกติ สำหรับเกลือ NaCl เมื่อความเข้มข้นสูงกว่า 0.1 โมลาร์ จะยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ เกลือ CaCl2 และ MgCl2 ที่ทุกความเข้มข้นที่ทดสอบจนถึง 0.5 โมลาร์ มีผลยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ DTT ซึ่งเป็นสารประกอบ reducing agent ช่วยป้องกันเอนไซม์จากการถูกยับยั้งโดย p-chloromercuriphenyl sulfonic acid ซึ่งเป็นสารประกอบ sulfhydryl-reactive จากการทดลองหาน้ำหนักโมเลกุลของเอนไซม์ พบว่า เอนไซม์บีเทนอัลดีฮายด์ดีไฮโดรจีเนสจาก A.halophytica มีน้ำหนักโมเลกุลเท่ากับ 120,000 ดาลตัน ซึ่งประกอบด้วย 4 หน่วยย่อยที่มีน้ำหนักโมเลกุลของแต่ละหน่วยย่อยเท่ากับ 30,000 ดาลตัน การศึกษาผลของความสัมพันธ์ระหว่างความเข้มข้นของ เกลือภายนอกเซลล์และแอคติวิตีจำเพาะของเอนไซม์พบว่า เมื่อความเข้มข้นของเกลือภายนอกเซลล์สูงขึ้น แอคติวิตีจำเพาะของเอนไซม์เพิ่มขึ้น ซึ่งมีความเป็นไปได้ว่าเกลือจากภายนอก มีผลในการชักนำให้มีการสังเคราะห์เอนไซม์เพิ่มขึ้นซึ่งเป็น วิธีที่เซลล์ตอบสนองต่อภาวะกดดันโดยเกลือ
Description: Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 1997
Degree Name: Master of Science
Degree Level: Master's Degree
Degree Discipline: Biochemistry
URI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/9474
ISBN: 9746390538
Type: Thesis
Appears in Collections:Grad - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Uthaiwon_Ku_front.pdf824.98 kBAdobe PDFView/Open
Uthaiwon_Ku_ch1.pdf917.23 kBAdobe PDFView/Open
Uthaiwon_Ku_ch2.pdf905.12 kBAdobe PDFView/Open
Uthaiwon_Ku_ch3.pdf989.61 kBAdobe PDFView/Open
Uthaiwon_Ku_ch4.pdf751.07 kBAdobe PDFView/Open
Uthaiwon_Ku_ch5.pdf690.62 kBAdobe PDFView/Open
Uthaiwon_Ku_back.pdf809.95 kBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.