การเตรียมให้บริสุทธิ์บางส่วนและสมบัติของไคทิเนสจาก Bacillus cereus

Abstract

Bacillus sp. ที่ใช้ในการวิจัยนี้เป็น Bacillus cereus สามารถผลิตไคทิเนสและขับไคทิเนสออกสู่อาหารเลี้ยงเชื้อ เมื่อเลี้ยงแบคทีเรียในอาหารเลี้ยงเชื้อสูตรปรับต่ำ ที่มีคอลลอยดัลไคทินเป็นองค์ประกอบอยู่ 0.2 เปอร์เซนต์ ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เมื่อศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างการเจริญและการผลิตไคทิเนส พบว่าแบคทีเรียจะผลิตไคทิเนสได้ก่อนที่จะสังเกตเห็นการเจริญของเซลล์ เอนไซม์จะมีแอคติวิตีสูงสุดที่ 32 ชั่วโมง ซึ่งเป็นช่วงที่เซลล์เข้าสู่ระยะการเจริญคงที่ และระดับเอนไซม์ยังคงสูงอยู่ตลอด 120 ชั่วโมงที่ศึกษา pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมของเอนไซม์อย่างหยาบในการย่อยคอลลอยดัลไคทินคือ 5.0 และ 60-65 องศาเซลเซียส ตามลำดับ การทำเอนไซม์ให้บริสุทธิ์ขึ้นด้วย โครมาโตกราฟีคอลัมน์รีเจนเนอเรทเทดไคทินพบว่ามีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 27.78 เท่า และมีผลผลิตเอนไซม์ 28.89 เปอร์เซนต์ จากการศึกษาสมบัติของไคทิเนสจาก Bacillus sereus หลังจากผ่านคอลัมน์รีเจนเนอเรทเทดไคทินพบว่าไคทิเนสที่เชื้อผลิตได้ สามารถย้อมติดสีย้อมไคทิเนส ในเอสดีเอส-พอลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโทรฟอรีซีสได้ทั้งหมด 5 แถบ ซึ่งมีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 45 58 60 70 และ 80 กิโลดาลตัน ในขณะที่แยกได้เพียง 2 แถบในดิสค์-พอลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโทรฟอรีซีส นอกจากนี้ยังพบว่าเอนไซม์มีสมบัติเป็นไกลโคโปรตีน pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมของเอนไซม์ผสม ที่ได้จากการทำให้บริสุทธิ์บางส่วนในการย่อยคอลลอยดัลไคทินคือ 4.0-6.0 และ 40-50 องศาเซลเซียส ตามลำดับ เอนไซม์ค่อนข้างเสถียรในช่วง pH ที่กว้างคือ pH 4-10 เอนไซม์สามารถไฮโดรไลซ์คอลลอยดัลไคทิน รีเจนเนอเรทเทดไคทิน ไกลคอลไคทิน ไคทินผงที่บริสุทธิ์ ไกลคอลไคโตแซน และ flaked chitosan (~90% deacetylation) ได้ดีตามลำดับจากมากไปน้อย และไม่ไฮโดรไลซ์ไคทินผง (ที่ไม่บริสุทธิ์ ขนาด 60 mesh) เซลลูโลส และคาร์บอกซีเมทธิลเซลลูโลส มีค่า Km ของเอนไซม์ต่อการย่อยคอลลอยดัลไคทินเท่ากับ 0.922 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร จากการตรวจสอบชนิดของไคทิเนสพบว่า เอนไซม์มีแอคติวิตีของไคโทไบโอซิเดสและเอ็นโดไคทิเนสในอัตราส่วน 24.60:2.43 และไม่มีแอคติวิตีของเอ็น-อะซิทิลกลูโคซามินิเดส