จลนพลศาสตร์ของการจับระหว่างอะโปเซอรูโลพลาสมินกับตะกั่วหรือทองแดง

Abstract

ในการศึกษาจลนพลศาสตร์ของการจับระหว่างอะโอเซอรูโลพลาสมินของคนกับโลหะ จำเป็นต้องใช้อะโปเซอร์โลพลาสมิน จึงทดสอบความสามารถของสารขับโลหะ 4 ชนิด ได้แก่ penicillamine, DMPS, DTC และ EDTA ในการดึงทองแดงออกจากโมเลกุลของโฮโลเซอรูโลพลาสมิน พบว่าสารจับโลหะ 3 ชนิดแรกสามารถดึงทองแดงที่มีส่วนเกี่ยวข้องกับออกซิเดส แอคติวิตีได้อย่างสมบูรณ์ที่ความเข้มข้น 1.0, 1.0 และ 3.5 มก./มล. ตามลำดับ ส่วน EDTA ที่ 3.5 มก./มล. สามารถลดแอคติวิตีลงได้เพียง 80% เมื่อเปรียบเทียบดูการเคลื่อนที่ในสนามไฟฟ้าระหว่างโฮโลเซอรูโลพลาสมินกับเซอรูโลพลาสมินทำปฏิกิริยากับสารจับโลหะทั้ง 4 ชนิด ในอิเล็กโทรโฟริซีสแบบไม่เสียสภาพที่ pH 8.8 และไอโซอิเลคทริกโฟกัสซิง พอลิอะคริลาไมด์เจลในช่วง pH 4-6 ไม่พบความแตกต่างของทุกตัวในระบบเจลทั้ง 2 ชนิด แต่ในยูเรียพอลิอะคริลาไมด์เจลที่ pH 8.4 พบว่าโฮโลเซอรูโลพลาสมินที่ทำปฏิกิริยากับสารจับโลหะ DTC เคลื่อนที่ช้ากว่าโฮโลเซอรูโลพลาสมินอยู่เล็กน้อยในยูเรียพอลิอะคริลาไมด์เจลที่ pH 8.4 ทำให้สันนิษฐานได้ว่าบริเวณที่จับกับทองแดงอยู่ภายในโมเลกุลของโปรตีน หลังจากทำปฏิกิริยากับ DMPS และ DTC พบว่าเซอรูโลพลาสมินยังมีทองแดงเหลืออยู่ในโมเลกุล 30% และ 25% ตามลำดับ จึงเตรียมอะโปเซอรูโลพลาสมินที่มีปริมาณทองแดงน้อยลงโดยไดแอไลซ์กับสารกับโลหะ DTC 5 mg/ml ร่วมกับ ascorbic acid 10 mM ที่ 4 ํ ซ, 5 ซม. อะโปเซอรูโลพลาสมินที่ได้มีปริมาณทองแดงเพียง 2% นำอะโปเซอรูโลพลาสมินไปศึกษาทางจลนพลศาสตร์ของการจับกับโลหะ จากการวิเคราะห์โดยกราฟแบบ metal-saturation curve และ double reciprocal plot พบว่าทองแดงเข้าจับกับอะโปเซอรูโลพลาสมินแบบ non-cooperativity ซึ่งมีค่าคงที่ของการแตกตัว (Kd) เท่ากับ 3.20 muM จำนวนทองแดงที่จับกับอะโปเซอรูโลพลาสมินสูงสุด (n) เท่ากับ 7.25 อะตอมต่อโมเลกุล ผลจาก Scatchard plot แสดงว่าตำแหน่งที่จับกับทองแดงอาจมีมากกว่า 1 ชนิด ส่วนการจับระหว่างอะโปเซอรูโลพลาสมินกับตะกั่วแตกต่างกับทองแดงคือ metal-saturation curve ชี้ให้เห็นว่าเป็นแบบ positive allostericity และ Hill plot ให้ค่า nH (maximum Hill slope) เท่ากับ 3.42 สำหรับการจับอย่างแน่น Kd เท่ากับ 1.10 muM และจำนวนตะกั่วที่เข้าจับเท่ากับ 2.54 อะตอมต่อโมเลกุล สำหรับการจับอย่างหลวมค่า Kd เท่ากับ 2.67 muM และจำนวนตะกั่วที่เข้าจับเท่ากับ 2.84 อะตอมต่อโมเลกุล ได้ศึกษาการจับระหว่างตะกั่วกับโฮโลเซอรูโลพลาสมินด้วย เพื่อยืนยันว่าตะกั่วสามารถแทนที่ทองแดงในโฮโลเซอรูโลพลาสมินพบว่ารูปแบบการจับเป็นแบบ positive allostericity เช่นกัน มีค่า nH (maximum Hill slope) เท่ากับ 1.72 สำหรับการจับอย่างแน่น Kd เท่ากับ 0.54 muM และจำนวนตะกั่วที่เข้าจับ เท่ากับ 1.49 สำหรับการจับอย่างหลวมค่า Kd เท่ากับ 2.80 muM และจำนวนตะกั่วที่เข้าจับเท่ากับ 1.79 ผลที่ได้เสนอว่า allosterism อาจเป็นปัจจัยสำคัญที่ทำให้เกิดการแทนที่