การคัดแยกและลักษณะสมบัติของราที่สลายสารพอลิไซคลิกแอโรแมติกไฮโดรคาร์บอน

กุลนี ชูพึ่งอาตม์

Please use this identifier to cite or link to this item: https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/13868

Title:	การคัดแยกและลักษณะสมบัติของราที่สลายสารพอลิไซคลิกแอโรแมติกไฮโดรคาร์บอน
Other Titles:	Isolation and characterization of polycyclic aromatic hydrocarbon degrading fungi
Authors:	กุลนี ชูพึ่งอาตม์
Advisors:	สุเทพ ธนียวัน ปาหนัน เริงสำราญ
Other author:	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์
Advisor's Email:	Suthep.T@Chula.ac.th Panan.R@Chula.ac.th
Subjects:	โพลิไซคลิกอะโรมาติคไฮโดรคาร์บอน เชื้อรา
Issue Date:	2550
Publisher:	จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
Abstract:	งานวิจัยนี้ได้คัดแยกราที่มีความสามารถสูงในการย่อยสลายสารประกอบกลุ่มพอลิไซคลิกแอโรแมติกไฮโดรคาร์บอน โดยเก็บตัวอย่างราจากแหล่งต่างๆในประเทศไทยและนำมาแยกเชื้อให้บริสุทธิ์ จากตัวอย่างราที่แยกได้ทั้งหมด 153 ไอโซเลต พบว่ามีเพียง 1.3% ที่ได้แสดงความสามารถสูงในการย่อยสลายสารประกอบกลุ่มดังกล่าว จากการพิสูจน์เอกลักษณ์ของราโดยการเปรียบเทียบลำดับนิวคลีโอไทด์ระหว่างบริเวณ ITS1 และ ITS2 พบว่าไอโซเลตที่มีความสามารถสูงสุดในการย่อย PAH ได้หลายชนิดคือ Agrocybe sp. CU-43 รองลงมาได้แก่ Xylaria sp. CU-1 เมื่อทดสอบในอาหารที่มีไนโตรเจนจำกัด พบว่าราทั้ง 2 สายพันธุ์สามารถย่อย PAH ความเข้มข้น 100 มก. ต่อลิตรหลายชนิดได้ดี โดยพบว่า Agrocybe sp. CU-43 และ Xylaria sp. CU-1 สามารถย่อยสลายฟลูออรีนได้ดีที่สุดคือย่อยสลายได้ 100% และ 94.5% ภายใน 6 วัน ตามลำดับ และสามารถย่อยสลายแอนทราซีนได้ 91.2% และ 68.0% ย่อยฟีแนนทรีนได้ 99.2% และ 71.0% ภายใน 21 วัน ย่อยฟลูออแรนทรีนได้ 67.9% และ 24.3% และย่อยไพรีนได้ 81.2% และ 24.3% ภายใน 30 วันตามลำดับ และพบว่า Agrocybe sp. CU-43 สามารถทนต่อฟลูออรีนได้สูงถึง 750 มก. ต่อลิตร สารมัธยันตร์ที่ได้จากการย่อยสลายฟลูออรีนที่สำคัญ ได้แก่ 9-ฟลูออรีนอลซึ่งพบเป็นสารมัธยันตร์หลักและ 9-ฟลูออรีโนน โดยสารมัธยันตร์ทั้ง 2 ชนิด มีความเป็นพิษน้อยกว่าฟลูออรีน และพบว่า 9-ฟลูออรีนอลไม่ใช่สารมัธยันตร์สุดท้ายของกระบวนการย่อยสลายฟลูออรีน Agrocybe sp. CU-43 สามารถผลิตแลคเคสได้สูง ร่วมกับผลิตแมงกานีสเพอร์ออกซิเดสในระหว่างที่มีการย่อยสลายฟลูออรีนเข้มข้น 500 มก. ต่อลิตร โดยมีแอคติวิตีของแลคเคสสูงสุดในสัปดาห์ที่ 3 เท่ากับ 470 หน่วยต่อมล. และแมงกานีสเพอร์ออกซิเดสสูงสุดในสัปดาห์ที่ 4 เท่ากับ 4.34 หน่วยต่อ มล. แต่ไม่พบแอคติวิตีของลิกนินเปอร์ออกซิเดส จากการตรวจสอบการแสดงออกของยีนแลดเคสซึ่งเป็นเอนไซม์หลักที่เกี่ยวข้องกับการสลายฟลูออรีน โดยการออกแบบไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อแลคเคสของ Agrocybe sp. CU-43 พบว่าการแสดงออกของยีนแลคเคสสอดคล้องกับแอคติวิตีที่ตรวจพบในระหว่างการย่อยสลายฟลูออรีน นอกจากนี้รา Agrocybe sp. CU-43 ยังมีการเจริญได้ดีในระหว่างการย่อยสลายฟลูออรีนเข้มข้น 500 มก. ต่อลิตรด้วย Agrocybe sp. CU-43 ยังสามารถย่อยสายฟลูออรีนความเข้มข้น 250 ไมโครกรัมต่อดินแห้ง 1 กรัมในแบบจำลองดินได้ ทั้งในภาวะที่ปลอดเชื้อซึ่งย่อยฟลูออรีนได้อย่างสมบูรณ์ และในภาวะที่อยู่ร่วมกับเชื้อท้องถิ่นที่สามารถย่อยฟลูออรีนได้ 98% ในเวลา 4 สัปดาห์ งานวิจัยนี้เป็นงานวิจัยแรกที่ได้รายงานการพบแอคติวิตีและการแสดงออกของแลคเคส ในระหว่างการย่อยสลายฟลูออรีนด้วยราในสกุล Agrocybe และเป็นรายงานแรกที่ได้แสดงลำดับนิวคลีโอไทด์บางส่วนของยีนแลคเคสของราในสกุล Agrocybe รวมทั้งเป็นรายงานแรกที่แสดงว่าราในสกุล Xylaria สามารถย่อยสลายสารประกอบพอลิไซคลิกแอโรมาติกไฮโดรคาร์บอนได้ รา Xylaria sp. CU-1 และ Agrocybe sp. CU-43 ที่คัดแยกได้จากงานวิจัยนี้มีศักยภาพสูง ในการนำไปประยุกต์ใช้เพื่อบำบัดการปนเปื้อนของสารประกอบพอลิไซคลิกแอโรแมติกไฮโดรคาร์บอน ในน้ำและในดินได้ต่อไป
Other Abstract:	The present study investigated PAHs biodegradation by fungi isolated and available in Thailand. Among 153 isolates, only 1.3% showed high degradation potential. The results from fungal identification by comparing ITS1 to ITS2 region of the rRNA encoding region suggested that the high PAHs PAHs degrading fungi were Agrocybe sp. CU-43 and Xylaria sp. CU-1. PAHs tested were added to the medium at 100 ppm, supernatant obtained after incubation were extracted and subjected to HPLC analysis for the presence of PAHs and/or its respective metabolites. Agrocybe sp. CU-43 and Xylaria sp. CU-1 showed 100% and 94.5% degradation of fluorene within 6 days, 91.2% and 68.0% for anthracene and 99.2% and 71.0% for phenanthrene in 21 days. Fluoranthene was degraded 67.9%, 24.3% and pyrene was degraded 81.2%, 24.3 % within 30 days by Agrocybe sp. CU-43 and Xylaria sp. CU-1 respectively. Agrocybe sp. CU-43 showed potential to degrade fluorene up to 750 ppm. The intermediates obtained when analysed by reversed-phase HPLC equipped with a C18 column was identified as 9-fluorenol and 9-fluorenone, the less toxic intermediates of fluorene. The major intermediate, 9-fluorenol, was not dead-end metabolite during fluorene degradation. High activities of laccase, manganese peroxidase were detected during 500 ppm fluorene degradation in N-limiting medium but not lignin peroxidase. The activities of laccase peaked in the 3rdweek at 470 unit/ml and the hightest manganese peroxidase activities was found in the final week which was 4.34 unit/ml. Reverse transcription-PCR with specific primers for Agrocybe sp. CU-43 laccase gene revealed that laccase expression was correlated to laccase activities during fluorene degradation in N-limiting medium Agrocybe sp. CU-43 showed potential to degrade 250 ppm fluorene in soil model, fluorene was completely degraded within 4 weeks in sterile condition and 98% degraded when Agrocybe sp. CU-43 and soil microflora were used. This work is the first report of laccase activity and its expression during fluorene degradation by Agrocybe spp. as well as reports the partial nucleotide sequence of laccase gene in Agrocybe spp. It is also the first to report potential of Xylaria spp. in degrading PAHs. Xylaria sp. CU-1 and Agrocybe sp. CU-43 isolated from this work therefore have potential for fungal bioremediation in water and soil.
Description:	วิทยานิพนธ์ (วท.ด.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2550
Degree Name:	วิทยาศาสตรดุษฎีบัณฑิต
Degree Level:	ปริญญาเอก
Degree Discipline:	เทคโนโลยีชีวภาพ
URI:	http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/13868
URI:	http://doi.org/10.14457/CU.the.2007.1766
metadata.dc.identifier.DOI:	10.14457/CU.the.2007.1766
Type:	Thesis
Appears in Collections:	Sci - Theses

Files in This Item:

File	Description	Size	Format
Kunlanee_ Ch.pdf		3.14 MB	Adobe PDF	View/Open

Show full item record