Please use this identifier to cite or link to this item:
https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/14489
| Title: | การโคลนและการหาลำดับของยีนเดกซ์แทรนเนสจาก Penicillium sp. SMCU 3-14 |
| Other Titles: | Cloning and sequencing of dextranase gene from Penicillium sp. SMCU 3-14 |
| Authors: | พิมลรัตน์ เต็มจิตต์ภักดี |
| Advisors: | ปาหนัน เริงสำราญ สุพัฒน์ เจริญพรวัฒนา |
| Other author: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์ |
| Advisor's Email: | Panan.R@Chula.ac.th pat.c@sc.chula.ac.th |
| Subjects: | การโคลนยีน จุลินทรีย์ |
| Issue Date: | 2549 |
| Publisher: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย |
| Abstract: | งานวิจัยนี้ได้โคลนและหาลำดับจีโนมิกดีเอ็นเอของยีนเดกซ์แทรนเนสจาก Penicillium sp.SMCU 3-14 โดยใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสด้วยชุด BD GenomeWalker[superscript TM] Universal Kit โดยตัดจีโนมิกดีเอ็นเอของรานี้ด้วยเรสทริกชันเอนไซม์ชนิดต่างๆ แล้วเชื่อมเข้ากับอะแด๊ปเตอร์ จากนั้นเพิ่มจำนวนชิ้นส่วนของยีนเดกซ์แทรนเนสด้วยไพรเมอร์ 2 คู่(Dex6R กับ AP2 และ Dex4F กับ AP2) แล้วโคลนผลิตภัณฑ์ PCR ขนาด 2.5 กิโลเบส และ 2.4กิโลเบสเข้าในเวกเตอร์ ระบุรีคอมบิแนนท์พลาสมิดที่ได้เป็น pPT-4 และ pPT-5 ตามลำดับ เมื่อวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของ PT-4และ PT-5 พบว่ามีความเหมือน 92% และ 96% ตามลำดับ กับปลายด้าน 5’(ก่อนโปรโมเตอร์)และปลายด้าน 3’(หลังกรอบอ่านรหัสเปิด) ของเดกซ์แทรนเนสของ Penicillium minioluteum HI-4 ดังนั้นเพื่อให้ได้ยีนประมวลรหัสเดกซ์แทรนเนสของ Penicillium sp.SMCU 3-14 (SMCU-dex) ที่สมบูรณ์อยู่ภายในชิ้นเดียวกันได้ใช้ข้อมูลที่จำเพาะต่อดีเอ็นเอบริเวณปลายด้าน 5’ ของPT-4 และปลายด้าน 3' ของ PT-5 ออกแบบ forward primer และ reverse primer ตามลำดับ เพิ่มชิ้นส่วนของ SMCU-dex โดยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส แล้วโคลนผลิตภัณฑ์ PCR เข้าในเวกเตอร์ ระบุรีคอมบิแนนท์พลาสมิดที่ได้เป็นpPT-6 เมื่อวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของชิ้นดีเอ็นเอทั้งหมดที่โคลนได้ พบตำแหน่งของโปรโมเตอร์ซึ่งประกอบด้วย CAAT Box และ TATA Box ที่มีลำดับนิวคลิโอไทด์เป็น CCAATและ TATAA ตามลำดับ และพบ Poly A signal ที่มีลำดับนิวคลีโอไทด์เป็น AATAAGกรอบอ่านรหัสเปิดของ SMCU-dex มีขนาด 1824 คู่เบส ที่ไม่มีอินทรอนและประมวลรหัสให้โปรตีนที่ประกอบด้วยกรดอะมิโน 608 หมู่ขนาดประมาณ 66 กิโลดาลตัน ที่บริเวณปลาย N-terminal พบ signal peptide ที่ประกอบด้วยกรดอะมิโนยาว 20 หมู่ เมื่อเปรียบเทียบความเหมือนของโปรตีน SMCU-DEX พบว่ามีความเหมือน 99% กับเดกซ์เเทรนเนสของ Penicillium minioluteum HI-4 ผลการทดลองจากเซาเทิร์นไฮบริไดเซชัน แสดงว่ามี SMCU-dex เพียงหนึ่งชุดในโครโมโซมของรานี้ ผลการวิเคราะห์ลำดับเบสบริเวณ ITS1-5.8S-ITS2 ระบุว่า ราสายพันธุ์นี้มีความเหมือน 100% กับ Penicillium pinophilum งานวิจัยนี้จึงเป็นงานวิจัยแรกที่เสนอข้อมูลจากยีนเดกซ์แทรนเนสของราสายพันธุ์นี้ |
| Other Abstract: | The DNA fragment encoding dextranase was cloned and amplified from the genomic DNA of Penicillium sp.SMCU 3-14 by using BD GenomeWalker[superscript TM] Universal Kit. The genomic DNA was digested with restriction enzymes and ligated to adaptors. The libraries obtained were used as template to amplified fragments of the dextranase gene using two pairs of primers; Dex6R+AP2 and Dex4F+AP2. The 2.5 kb and 2.4 kb PCR products were cloned into plasmid vector, the recombinant plasmids were designated as pPT-4 and pPT-5. Sequences of PT-4 and PT-5 revealed 92% and 96% sequences identity to 5' and 3' non-coding sequences of dextranase from Penicillium minioluteum HI-4, respectively. To obtain complete genomic DNA encoding dextranase gene (SMCU-dex) in a single fragment, forward and reverse primers specific to 5’ and 3’ non-coding sequences were designed and used to perform PCR using genomic DNA of Penicillium sp.SMCU 3-14 as template. The PCR product was cloned into plasmid vector and the recombinant plasmid was designated as pPT-6.The complete dextranase gene contained promoter with CAAT Box-like sequence; CCAAT, and TATA Box-like sequence; TATAA, as well as a polyadenylation signal; AATAAG. The open reading frame composed of 1,824 bp which encoded a protein of 608 amino acids with predicted molecular mass of 66 kDa, including 20 N-terminal amino acid residues corresponded to a signal peptide. Amino acid sequence of the protein SMCU-DEX revealed 99% identity to dextranase of Penicillium minioluteum HI-4. Southern Hybridization revealed only one copy of dextranase gene in the chromosome. The ITS1-5.8S-ITS2 region of this fungus is 100% identitcal to that of Penicillium pinophilum. Hence, this is the first report of dextranase gene sequence in Penicillium pinophilum. |
| Description: | วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2549 |
| Degree Name: | วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต |
| Degree Level: | ปริญญาโท |
| Degree Discipline: | จุลชีววิทยาทางอุตสาหกรรม |
| URI: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/14489 |
| URI: | http://doi.org/10.14457/CU.the.2006.590 |
| metadata.dc.identifier.DOI: | 10.14457/CU.the.2006.590 |
| Type: | Thesis |
| Appears in Collections: | Sci - Theses |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| pimonrut.pdf | 2.59 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.