การตัดต่อและการแสดงออกของยีนเพนนิซิลิน เอซิเลสจากเอสเคอริเคีย โคไล

Abstract

การวิจัยนี้อาศัยเทคนิคทางพันธุวิศวกรรม ในการเพิ่มปริมาณการผลิตเอนไซม์เพนนิซิลินเอซิเลส (PA) โดยเริ่มจาก เอสเคอริเคีย โคไล เอทีซีซี 11105 ซึ่งเป็นสายพันธุ์ที่สามารถผลิต PA ได้ ในขั้นต้นของการทำ molecular cloning ได้ตัดยีน PA จากโครโมโซมของ อี.โคไล เอทีซีซี 11105 และตัดพลาสมิดดีเอนเอพาหะที่มีคุณสมบัติ runaway-replication ซึ่งมีชื่อว่า pSY 343 โดยใช้เอนไซม์เรสตริกชัน Hind III และ EcoR I หลังจากเชื่อมขึ้นดีเอนเอด้วยเอนไซม์ T4 –DNA ligase แล้ว จึงเคลื่อนย้ายพลาสมิดที่สร้างขึ้นใหม่เข้าสู่เซลล์เจ้าเรือน อี.โคไล HB 101 แล้วคัดเลือกทรานสฟอร์แมนต์ ที่สามารถผลิต PA ได้ โดยอาศัยวิธีการสังเกตบริเวณใสของเซอราเทีย มาเซสเซน เอทีซีซี 27117 รอบๆ โคโลนีของทรานฟอร์แมนต์ที่สามารถผลิต PA ได้ รีคอมบิแนนท์พลาสมิดดีเอนเอใหม่ที่มียีน PA ให้ชื่อว่า 69 และทรานสฟอร์แมนท์ ที่สารถผลิต PA ได้ให้ชื่อว่า Q69 pJR 69 มีขนาดประมาณ 11 กิโลเบส การถอดรหัสของยีน PA ในสภาวะที่เหมาะสม ทำให้ Q69 สามารถต้านยาเพนนิซิลินจี 200 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตรและสามารถผลิต PA ที่มีแอคติวิตีสูงสุด 355.0 นาโนโมลของกรดพารา-อะมิโนโซอิคต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน ถ้านำค่าสูงสุดที่ได้เทียบกับค่าสูงสุดของ PA เดิมที่พบใน อี.โคไล เอทีซีซี 11105แล้วจะพบว่าแอคติวิตีสูงขึ้น 9.3 เท่า นอกจากนี้ยังพบว่า การถอดรหัสของเอนไซม์ PA ยังเปลี่ยนจากโอเปอรอนที่ต้องการตัวชักนำมาเป็นโอเปอรอนที่ถอดรหัสได้ตลอดเวลา เนื่องจากการสร้าง pA ของ Q69 ยังคงถูกกดดันด้วยกลุโคสในอาหาร ดังนั้นจึงได้ชักนำการกลายพันธุ์เพื่อแยกสายพันธุ์ใหม่ที่สามารถใช้กลูโคสเป็นสารต้นตอคาร์บอน พร้อมทั้งถอดหัส PA ได้อีกด้วยการวิจัยนี้เลือกใช้รังสีอุลตราไวโอเลต และ N-methyl- Ń -nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) สำหรับการกลายพันธุ์ ในการกลายพันธุ์ด้วยรังสีอุลตราไวโอเลตนั้น สามารถแยกได้มิวแตนส์ซึ่งมีคุณสมบัติ catabolite derepressed หลายตัว หลังจากทดสอบแล้วพบว่าสายพันธุ์ R9 สามารถผลิต PA ได้สูงสุดในสภาวะที่เหมาะสมต่อการเจริญ R9 สามารถผลิต PA ได้มีแอคติวิตีสูงสุด 661.8 นาโนโมล ของกรดพราอะมิโนเบนโซอิค ต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน ซึ่งถ้านำค่าสูงสุดที่ได้นี้เทียบกับค่าสูงสุดของ PA จาก Q69 พบว่า แอคติวิตีสูงขึ้น 1.9 เท่า ส่วนการกลายพันธุ์ด้วยสาร NTG นั้น สามารถแยกได้มิวแตนท์ซึ่งมีคุณสมบัติ catabolite derepressed หลายตัว หลังจากทดสอบแล้วพบว่าสายพันธุ์ S5 สามารถผลิต PA ได้สูงสุด ในสภาวะที่เหมาะสมต่อการเจริญ S5 สามารถผลิต PA ได้มีแอคติวิตีสูงสุดใกล้เคียงกับ R9 ความแตกต่างระหว่างสายพันธุ์ทั้งสองนี้อยู่ที่ S5 มีความเสถียรกว่า ซึ่งมีความเหมาะสมสำหรับใช้ในการผลิต PA