1. CUIR at Chulalongkorn University
  2. Faculty and Institute
  3. Graduate School - Grad
  4. Grad - Theses
Please use this identifier to cite or link to this item: https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/17946
Full metadata record
DC FieldValueLanguage
dc.contributor.advisorไพเราะ ทิพยทัศน์-
dc.contributor.authorจรัญญา เงินประเสริฐศิริ-
dc.contributor.otherจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. บัณฑิตวิทยาลัย-
dc.date.accessioned2012-03-14T15:41:48Z-
dc.date.available2012-03-14T15:41:48Z-
dc.date.issued2528-
dc.identifier.isbn9745649392-
dc.identifier.urihttp://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/17946-
dc.descriptionวิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย,2528en
dc.description.abstractการวิจัยนี้อาศัยเทคนิคทางพันธุวิศวกรรม ในการเพิ่มปริมาณการผลิตเอนไซม์เพนนิซิลินเอซิเลส (PA) โดยเริ่มจาก เอสเคอริเคีย โคไล เอทีซีซี 11105 ซึ่งเป็นสายพันธุ์ที่สามารถผลิต PA ได้ ในขั้นต้นของการทำ molecular cloning ได้ตัดยีน PA จากโครโมโซมของ อี.โคไล เอทีซีซี 11105 และตัดพลาสมิดดีเอนเอพาหะที่มีคุณสมบัติ runaway-replication ซึ่งมีชื่อว่า pSY 343 โดยใช้เอนไซม์เรสตริกชัน Hind III และ EcoR I หลังจากเชื่อมขึ้นดีเอนเอด้วยเอนไซม์ T4 –DNA ligase แล้ว จึงเคลื่อนย้ายพลาสมิดที่สร้างขึ้นใหม่เข้าสู่เซลล์เจ้าเรือน อี.โคไล HB 101 แล้วคัดเลือกทรานสฟอร์แมนต์ ที่สามารถผลิต PA ได้ โดยอาศัยวิธีการสังเกตบริเวณใสของเซอราเทีย มาเซสเซน เอทีซีซี 27117 รอบๆ โคโลนีของทรานฟอร์แมนต์ที่สามารถผลิต PA ได้ รีคอมบิแนนท์พลาสมิดดีเอนเอใหม่ที่มียีน PA ให้ชื่อว่า 69 และทรานสฟอร์แมนท์ ที่สารถผลิต PA ได้ให้ชื่อว่า Q69 pJR 69 มีขนาดประมาณ 11 กิโลเบส การถอดรหัสของยีน PA ในสภาวะที่เหมาะสม ทำให้ Q69 สามารถต้านยาเพนนิซิลินจี 200 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตรและสามารถผลิต PA ที่มีแอคติวิตีสูงสุด 355.0 นาโนโมลของกรดพารา-อะมิโนโซอิคต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน ถ้านำค่าสูงสุดที่ได้เทียบกับค่าสูงสุดของ PA เดิมที่พบใน อี.โคไล เอทีซีซี 11105แล้วจะพบว่าแอคติวิตีสูงขึ้น 9.3 เท่า นอกจากนี้ยังพบว่า การถอดรหัสของเอนไซม์ PA ยังเปลี่ยนจากโอเปอรอนที่ต้องการตัวชักนำมาเป็นโอเปอรอนที่ถอดรหัสได้ตลอดเวลา เนื่องจากการสร้าง pA ของ Q69 ยังคงถูกกดดันด้วยกลุโคสในอาหาร ดังนั้นจึงได้ชักนำการกลายพันธุ์เพื่อแยกสายพันธุ์ใหม่ที่สามารถใช้กลูโคสเป็นสารต้นตอคาร์บอน พร้อมทั้งถอดหัส PA ได้อีกด้วยการวิจัยนี้เลือกใช้รังสีอุลตราไวโอเลต และ N-methyl- Ń -nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) สำหรับการกลายพันธุ์ ในการกลายพันธุ์ด้วยรังสีอุลตราไวโอเลตนั้น สามารถแยกได้มิวแตนส์ซึ่งมีคุณสมบัติ catabolite derepressed หลายตัว หลังจากทดสอบแล้วพบว่าสายพันธุ์ R9 สามารถผลิต PA ได้สูงสุดในสภาวะที่เหมาะสมต่อการเจริญ R9 สามารถผลิต PA ได้มีแอคติวิตีสูงสุด 661.8 นาโนโมล ของกรดพราอะมิโนเบนโซอิค ต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน ซึ่งถ้านำค่าสูงสุดที่ได้นี้เทียบกับค่าสูงสุดของ PA จาก Q69 พบว่า แอคติวิตีสูงขึ้น 1.9 เท่า ส่วนการกลายพันธุ์ด้วยสาร NTG นั้น สามารถแยกได้มิวแตนท์ซึ่งมีคุณสมบัติ catabolite derepressed หลายตัว หลังจากทดสอบแล้วพบว่าสายพันธุ์ S5 สามารถผลิต PA ได้สูงสุด ในสภาวะที่เหมาะสมต่อการเจริญ S5 สามารถผลิต PA ได้มีแอคติวิตีสูงสุดใกล้เคียงกับ R9 ความแตกต่างระหว่างสายพันธุ์ทั้งสองนี้อยู่ที่ S5 มีความเสถียรกว่า ซึ่งมีความเหมาะสมสำหรับใช้ในการผลิต PA-
dc.description.abstractalternativeThis work reported the attempt to improve the production of penicillin acylase (PA) by an application genetic engineering techniques. The PA gene was cloned from the chromosomal DNA of E.coli ATCC 11105. This gene was to be inserted into a runaway replication plasmid named pSY 343. Plasmid pSY 343 was double digested with resteicition enzymes Hind III and EcoR I and then joined by the action of T4- DNA ligase to the E.coli chromosomal DNA fragments containing PA gene which previously treated with the similar restriction enzymes as did pSY 343. The constructed plasmid DNA were transformed into recipient cells named E.coli HB 101 and PA producing transformant was screened and isolated by an observation of the inhibitory clear zone of Serratia marcescens ATCC 27117 around the colonies of transformant. The transformant containing expression plasmid pJR 69 was E.coli Q69. The size of pJR 69 was determined to be approximately 11 kilobase. The optimal conditions for the expression of PA gene caused Q69 to tolerate penicillin up to 200 microgram per milliliter and the maximum PA activity was 355.0 nmole of p-aminobenzoic acid per minute per milligram protein. This value was 9.3 fold higher than that obtained from E.coli ATCC 11105. Furthermore, an expression of P gene in Q69 was changed from formerly inducible to constitutive type of operon. The next objective of this work to produce strains being devoid of glucose effect by the technique of mutation. Ultraviolet radiation (UV) and N-methyl-Ń-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) were used for mutagenesis. By UV mutagenesis, many strains having derepressed catabolite effect were isolated. After characterization, a strain name R9 was found to be the best strain in the aspect of PA production. Under the optimal growth condition for R9’ 661.8 nmole PABA per min.per mg. protein were obtained and furthermore at this conditions, the maximal specific activity of PA from R9 was 1.9 folds higher than that from Q69. Finally, with an application of NTG mutagenesis, many strains which were devoid of glucose effect could be isolated. S5 was the strain with the highest level of PA activity under on optimal growth condition. The specific activity of PA including the maximal growth yield of S5 were very similar to those of R9. However, the difference between these two strains was due to the mutation resided in S5 causing this mutant more stable than R9. Therefore, this mutant may be suitable for PA production.-
dc.format.extent397396 bytes-
dc.format.extent374552 bytes-
dc.format.extent469492 bytes-
dc.format.extent923096 bytes-
dc.format.extent400595 bytes-
dc.format.extent328386 bytes-
dc.format.mimetypeapplication/pdf-
dc.format.mimetypeapplication/pdf-
dc.format.mimetypeapplication/pdf-
dc.format.mimetypeapplication/pdf-
dc.format.mimetypeapplication/pdf-
dc.format.mimetypeapplication/pdf-
dc.language.isothes
dc.publisherจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัยen
dc.rightsจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัยen
dc.subjectเพนนิซิลลินen
dc.subjectเอนไซม์ -- การสังเคราะห์en
dc.subjectเอสเคอริเคียโคไลen
dc.titleการตัดต่อและการแสดงออกของยีนเพนนิซิลิน เอซิเลสจากเอสเคอริเคีย โคไลen
dc.title.alternativeCloning and expression of the penicillin acylase gene from Escherichia colien
dc.typeThesises
dc.degree.nameวิทยาศาสตรมหาบัณฑิตes
dc.degree.levelปริญญาโทes
dc.degree.disciplineเทคโนโลยีชีวภาพes
dc.degree.grantorจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัยen
dc.email.advisorไม่มีข้อมูล-
Appears in Collections:Grad - Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Jarunya_Ng_front.pdf388.08 kBAdobe PDFView/Open
Jarunya_Ng_ch1.pdf365.77 kBAdobe PDFView/Open
Jarunya_Ng_ch2.pdf458.49 kBAdobe PDFView/Open
Jarunya_Ng_ch3.pdf901.46 kBAdobe PDFView/Open
Jarunya_Ng_ch4.pdf391.21 kBAdobe PDFView/Open
Jarunya_Ng_back.pdf320.69 kBAdobe PDFView/Open
Show simple item record


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.