Please use this identifier to cite or link to this item:
https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/18453
| Title: | การผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อเอคโตโดเมนของ Notch3 |
| Other Titles: | Production of monoclonal antibodies agains ectodoman of Notch3 |
| Authors: | สิริภาภรณ์ ผุยกัน |
| Advisors: | ธนาภัทร ปาลกะ |
| Other author: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะวิทยาศาสตร์ |
| Advisor's Email: | Tanapat.P@Chula.ac.th |
| Subjects: | โมโนโคลนอลแอนติบอดีย์ |
| Issue Date: | 2552 |
| Publisher: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย |
| Abstract: | Notch3 เป็นโพรโทอองโคยีน (protooncogene) ซึ่งมีหน้าที่ควบคุมการเจริญ การแปรสภาพเพื่อทำหน้าที่เฉพาะและกระบวนการตายของเซลล์แบบอะพอพโทซีส ในระบบภูมิคุ้มกัน Notch3 ควบคุมการพัฒนาของ regulatory T cell และกระบวนการแปรสภาพเพื่อไปทำหน้าที่เฉพาะของ helper T cell ความผิดปกติของ Notch3 มีความสัมพันธ์กับการเกิดมะเร็งและโรคในระบบประสาท งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่จำเพาะต่อเอคโตโดเมนของ Notch3 โดยทำการออกแบบไพร์เมอร์เพื่อสร้างตำแหน่งตัดของเอนไซม์ตัดจำเพาะภายในเอคโตโดเมนของยีน mNotch3 ที่บริเวณ EGF repeats 9-14 ภายหลังจากการตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะทำการเชื่อมต่อชิ้นยีน mNotch3 กับเวกเตอร์ pET-15b ซึ่งมีส่วนของฮีสติ ดีนแทกแทรกอยู่ที่ปลายทางด้าน 5’ จากนั้นนำรีคอมบิแนนท์พลาสมิดไปแสดงออกในเซลล์เจ้าบ้านแบคทีเรีย E. coli สายพันธุ์ BL21 (DE3) pLyS และ Rosetta gami B (DE3) pLyS ภายหลังการชักนำพบว่า E. coli สายพันธุ์ Rosetta gami B (DE3) pLyS สามารถผลิตโปรตีน mNotch3 ได้โปรตีนขนาดประมาณ 33 kDa จึงคัดเลือก E. coli สายพันธุ์นี้ในการหาภาวะที่เหมาะสมเพื่อผลิตโปรตีน mNotch3 ให้ได้มากที่สุด จากผลการทดลองพบว่าภาวะที่เหมาะสมในการผลิตโปรตีน mNotch3 คือที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ชักนำด้วย IPTG ที่ความเข้มข้น 0.3 มิลลิโมลาร์ ที่ค่าการดูดกลืนแสง 600 นาโนเมตรเท่ากับ 0.2-0.8 นาน 6 ชั่วโมง ทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ด้วยชุดน้ำยาสำเร็จรูป His-Select Nickel beads column affinity โปรตีน mNotch3 บริสุทธิ์ใช้เป็นแอนติเจนสำหรับกระตุ้นภูมิคุ้มกันในหนูไมซ์สายพันธุ์ BALB/c เพื่อผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดี ภายหลังจากการหลอมรวมเซลล์ม้ามกับเซลล์มัยอีโลมานำอาหารเลี้ยงเซลล์มาทดสอบการสร้างแอนติบอดีด้วยเทคนิค Western blot พบว่าได้เซลล์ไฮบริโดมาที่ผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีทั้งหมด 4 โคลน ได้แก่ 4/D8-D6, 2/D5-F6, 2/D5-G6 และ 2/D5-E2 และเมื่อทดสอบความสามารถของโมโนโคลนอลแอนติบอดีในการจับ mNotch3 ที่แสดงออกบนผิวของเซลล์ 293T ที่มีบริเวณเอคโตโดเมนของ mNotch3 ด้วยเทคนิค Cell ELISA พบว่าโมโนโคลนอลแอนติบอดีรหัสโคลน 4/D8-D6 และ 2/D5-F6 มีความจำเพาะต่อรีเซบเตอร์ที่ผิว ซึ่งโมโนโคลนอลแอนติบอดีเหล่านี้สามารถใช้ประโยชน์ในการศึกษาการแสดงออกของ Notch3 ในเซลล์และเนื้อเยื่อต่อไป |
| Other Abstract: | Notch 3 encodes cell surface receptor protein which is essential for development, and apoptosis of various cell types. In the immune system, Notch 3 regulates the development of regulatory T cell and differentiation of helper T cell. Dysregulation of Notch 3 is linked to cancer and neurological disorders. Aim of this research was to produce monoclonal antibodies against ligand-binding ectodomain of Notch 3. Primer sets overlapping the EGF 9-14 of Notch 3 were designed and the restriction enzymes recognition site was introduced at both ends. PCR amplification using this primer set and plasmid pcDNA-Notch 3 as template was carried out. The PCR products were digested and inserted into pET-15b expression vector in frame with histidine tag to created recombinant plasmid. The recombinant plasmid was introduced in E. coli BL21 (DE3) pLysS and Rosettagami B (DE3) pLysS. After induction using IPTG, it was found that only Rosettagami B(DE3) pLysS yielded expected protein product on SDS-PAGE with the size of 33 kDa. Therefore, Rosettagami B (DE3) pLysS harboring the recombinant plasmid gene was chosen as expression system for further optimization for productivity. Optimal conditions for recombinant protein production were obtained by cultivation at 37C, with IPTG induction time of 6 hr. The recombinant protein was purified using His-select Nickel beads column affinity and used as antigen to immunize BALB/c mice. After somatic cell fusions, culture supernatants were screened by Western blot and cell-ELISA for antibodies which recognizes native Notch 3. Four clones producing antibodies reacting specifically with Notch3 were obtained. Two clones (4/D8-D6 and 2/D5-F6) reacted specifically to Notch 3 in 293T cell line overexpressing mNotch 3 by cell-ELISA. These monoclonal antibodies are useful for monitoring Notch 3 expression in cells and tissues. |
| Description: | วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย,2552 |
| Degree Name: | วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต |
| Degree Level: | ปริญญาโท |
| Degree Discipline: | จุลชีววิทยาทางอุตสาหกรรม |
| URI: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/18453 |
| URI: | http://doi.org/10.14457/CU.the.2009.1294 |
| metadata.dc.identifier.DOI: | 10.14457/CU.the.2009.1294 |
| Type: | Thesis |
| Appears in Collections: | Sci - Theses |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| siripaporn_ph.pdf | 47.29 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.