การพัฒนาเทคนิคระดับโมเลกุลเพื่อการระบุสายพันธุ์ Salmonella enterica serovar typhimurium และ enteritidis โดย high resolution melting analysis

Abstract

High resolution melting analysis (HRM) เป็นเทคนิคทางอณูชีววิทยาที่ถูกนำมาประยุกต์ใช้ในการจำแนกสายพันธุ์แบคทีเรีย โดยอาศัยความแตกต่างของ melting profile บริเวณ variable number of tandem repeats (VNTR) ซึ่งมีความจำเพาะในแต่ละสายพันธุ์ งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาเทคนิค HRM มาประยุกต์ใช้ร่วมกับเทคนิค Multiple locus variable number tandem repeat (MLVA) แทนเทคนิค capillary electrophoresis (CE) เพื่อจำแนกความแตกต่างบริเวณ VNTR จากความแตกต่างของ melting profile โดยจำแนกความแตกต่างของบริเวณ VNTR ใน S. typhimurium ได้ทั้ง 4 ตำแหน่งเป้าหมาย (STTR9, STTR5, STTR6 และ STTR3) โดยให้ melting profile ต่างกันในทุกอัลลีล แต่ในเชื้อ S. enteritidis พบความแตกต่างของ melting profile เกิดขึ้นเพียง 1 ตำแหน่งเป้าหมาย (SE2) จาก 4 ตำแหน่งเป้าหมาย (SE1, SE2, SE5 และ SE9) ในการพัฒนาเทคนิค HRM ในตำแหน่งเป้าหมาย SE1, SE5 และ SE9 ใน S. enteritidis โดยการออกแบบไพรเมอร์ใหม่เพื่อให้ชิ้นส่วนดีเอ็นเอมีขนาดสั้นลงพบว่า เทคนิค HRM ไม่สามารถแยกความแตกต่างของ melting profile บริเวณ VNTR ในตำแหน่งเป้าหมายได้ สำหรับการประเมินความแม่นยำพบว่าการวิเคราะห์ S. typhimurium ด้วยเทคนิค HRM สามารถวิเคราะห์ซ้ำได้ในทุกๆ อัลลีลของ ตำแหน่ง STTR9, STTR5, STTR6 และ STTR3 และการทดสอบความคงทนต่อการเปลี่ยนแปลงสภาวะของการทดสอบพบว่า วิธีการสกัดดีเอ็นเอและระดับความเข้มข้นดีเอ็นเอ ไม่ส่งผลต่อการวิเคราะห์ความแตกต่างของบริเวณ VNTR ด้วยเทคนิค HRM เมื่อเปรียบเทียบผลการจำแนกความแตกต่างของ VNTR ระหว่างเทคนิค MLVA ร่วมกับเทคนิค CE และ เทคนิค HRM จำนวนเชื้อละ 50 ไอโซเลท พบว่าเทคนิค HRM สามารถจำแนกความแตกต่างบริเวณ VNTR ด้วย melting profile ใน S. typhimurium ให้ผลของ repeat units ตรงกับการจำแนกความแตกต่างด้วยเทคนิค CE ทั้ง 50 ไอโซเลท ดังนั้นการใช้เทคนิค MLVA ร่วมกับ HRM มาวิเคราะห์ความแตกต่างของบริเวณ VNTR ด้วย melting profile ในตำแหน่งเป้าหมายจึงมีความเป็นไปได้สูงโดยเฉพาะในเชื้อ S. typhimurium แต่สำหรับ S. enteritidis จำเป็นต้องมีการพัฒนาปรับปรุงเทคนิค HRM ต่อไป