ผลของชนิดของฟีดเดอร์เซลล์ และอาหารที่ใช้ในการรีเจนเนอเรทที่มีต่อการถ่ายยีนด้วย Agrobacterium tumefaciens เข้าสู่มะเขือเทศพันธุ์สีดาทิพย์ และสวีทเชอรี่ (Lycopersicon esculentum Mill. cultivar Seedatip and Sweet Cherry)

Abstract

การเตรียมฟีดเดอร์เซลล์จากแคลลัสของยาสูบ ที่ได้จากแผ่นใบที่เลี้ยงในอาหาร MS ที่เติม 2,4-D 0.1 mg/l พบว่า แคลลัสที่เจริญในอาหารดังกล่าวมีลักษณะแตกต่างกัน คอมแพกแคลลัสสีเขียวและสีขาวสามารถเจริญเป็นยอดได้ ในอาหาร KDMS ในเวลา 80 วัน ในขณะที่ไฟรเอเบิลแคลลัสที่มีลักษณะเซลล์ใสไม่มีสีเขียว เปลี่ยนเป็นสีน้ำตาลและตายไปในที่สุด เมื่อนำคอมแพกแคลลัสสีเขียวและสีขาวนี้มาเลี้ยงในอาหารเหลวสูตร MS ที่เติม 2,4-D 0.1 mg/l พบว่า ได้เซลล์แขวนลอยสีเหลืองอมเขียวที่เพิ่มปริมาณได้ และมีขนาดเล็ก กระจายตัวตัวดี เมื่อย้ายเซลล์แขวนลอยนี้มาเลี้ยงในอาหารเหลวสูตร MS ที่เติม IAA 0.1 mg/l และ kinetin 1.0 mg/l พบว่า เซลล์แขวนลอยเจริญเติบโตเป็นกลุ่มเซลล์มีขนาดใหญ่ขึ้นและเปลี่ยนเป็นสีน้ำตาล ซึ่งผลที่ได้ต่างจากการย้ายคอมแพกแคลลัสสีเขียวและสีขาวมาเลี้ยงในอาหารเหลวสูตร MS ที่เติม IAA 0.1 mg/l และ kinetin 1.0 mg/l โดยตรงที่พบว่า แคลลัสให้เซลล์แขวนลอยน้อย แต่มีการรีเจนเนอเรทเป็นยอดจำนวนมาก จึงไม่เหมาะที่จะนำมาใช้เป็นฟีดเดอร์เซลล์ สำหรับการเลี้ยงแคลลัสจากแผ่นใบพิทูเนียในอาหาร MS ที่เติม 2,4-D 1.0 mg/l พบว่าได้แคลลัสสีเขียวอมเหลือง ลักษณะเซลล์ค่อนข้างละเอียด เมื่อนำมาเลี้ยงในอาหาร medium B สามารถเกิดการรีเจนเนอเรทเป็นยอดได้ดี และเมื่อนำแคลลัสมาเลี้ยงในอาหารเหลว Medium P พบว่าได้เซลล์แขวนลอยสีเขียวอมเหลืองลักษณะเซลล์ละเอียด และกระจายตัวได้ดี ซึ่งสามารถใช้ฟีดเดอร์เซลล์ได้ จากการศึกษาพบว่าวิธีการถ่ายยีนเข้าสู่มะเขีอเทศพันธุ์สีดาทิพย์และสวีทเชอรี่รวม 18 การทดลอง โดยใช้ Agrobacterium tumefaciens สายพันธุ์ LBA 4404 ซึ่งมีพลาสมิด pBI121 ที่มี gus gene เป็นยีนรายงานผล และ npt II gene เป็นยีนเครื่องหมายสำหรับการคัดเลือก พบว่า ใบเลี้ยงของมะเขือเทศพันธุ์สีดาทิพย์ขยายขนาดได้ดีที่สุดเมื่อใช้เซลล์แขวนลอยพิทูเนียเป็นฟีดเดอร์โดยทำ preculture ด้วยเป็นเวลา 1 คืน และเลี้ยงบน regeneration medium III รองลงมา คือ การใช้เซลล์แขวนลอยยาสูบที่เลี้ยงในอาหาร MS ที่เติม IAA 0.1 mg/l และ kinetin 1.0 mg/l เป็นฟีดเดอร์โดยไม่ทำ preculture และเลี้ยงบน regeneration medium II ส่วนใบเลี้ยงมะเขือเทศพันธุ์สวีทเชอรี่ขยายขนาดได้ดีที่สุดเมื่อใช้เซลล์แขวนลอยพิทูเนียเป็นฟีดเดอร์ และเลี้ยงบน regeneration medium I รองลงมา คือ การใช้เซลล์แขวนลอยยาสูบที่เลี้ยงในอาหาร MS ที่เติม IAA 0.1 mg/l และ kinetin 1.0 mg/l เป็นฟีดเดอร์ และเลี้ยงบน regeneration medium II ทั้งนี้การ preculture และไม่ preculture ให้ผลไม่แตกต่างกันทางสถิติ ส่วนประสิทธิภาพในการถ่ายยีนเข้าสู่มะเขือเทศทั้ง 2 พันธุ์ จากทั้ง 18 การทดลอง พบว่า มะเขือเทศพันธุ์สีดาทิพย์ และพันธุ์สวีทเชอรี่มีค่า pupative transformation efficiency เป็น 2.5-18.0% และ 5.6-22.2% ตามลำดับ ต้นมะเขือเทศที่คาดว่าจะเป็นต้นที่ได้รับการถ่ายยีนได้ถูกนำมาตรวจสอบเอนไซม์กลูคูโรนิเดส โดยวิธี histochemical detection และโดยการเพิ่มชิ้นส่วนของยีน npt II โดยใช้ไพร์เมอร์จำเพาะ ซึ่งพบว่าพืชทุกต้นที่นำมาตรวจสอบให้ผลบวกในการตรวจสอบยีนทั้งสอง การทดสอบนี้ยืนยันประสิทธิภาพการถ่ายยีนว่าเป็นดังที่ระบุไว้ข้างต้น