การตรวจสอบยีนไนไทรต์รีดักเทสในดีไนทริฟายอิ้งแบคทีเรีย โดยเทคนิคพีซีอาร์-อาร์เอฟแอลพี

Abstract

ทำการคัดเลือกดีไนทริฟายอิ้งแบคทีเรีย(Denitrifying bacteria) จากดินบริเวณพื้นที่ป่าโครงการอนุรักษ์พันธุกรรมพืช ตามแนวพระราชดำริของสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดาสยามบรมราชกุมารี กองการเกษตรและสหกรณ์ สำนักงานทหารพัฒนา หน่วยบัญชาการทหารพัฒนา จังหวัดกาญจนบุรี ทั้งหมด 5 บริเวณ จำนวน 3 ครั้ง โดยการทำ soil dilution plate count บน nutrient agar จากนั้นแยกเชื้อให้บริสุทธิ์ แล้วนำมาทดสอบกระบวนการดีไนทริฟิเคชัน (Denitrification test) และทดสอบความสามารถในการเจริญบน nitrate agar ในภาวะไร้ออกซิเจน (Anaerobic condition) พบว่าได้แบคทีเรียที่ทำใหเช้เกิดกระบวนการดีไนทริฟิเคชันทั้งหมด 16 ไอโซเลต และได้แบคทีเรียที่สามารถเจริญบน nutrient agar ในภาวะไร้ออกซิเจน 49 ไอโซเลต โดยเป็นไอโซเลตเดียวกับที่เกิดกระบวนการดีไนทริฟิเคชัน 7 ไอโซเลต จากนั้นนำมาจัดจำแนกด้วยวิธีทางชีวเคมีด้วยชุดทดสอบ API พบว่าได้แบคทีเรียจากทั้งหมด 6 สกุล คือ Pseudomonas Alcaligenes Burkholderia Agrobacterium Corynebacterium และ Micrococcus เมื่อนำแบคทีเรียที่คัดเลือกได้มาทดสอบความสามารถในการลดไนเตรทและไนไทรต์ใน nitrate broth พบว่ามี 4 ไอโซเลต ที่ลดปริมาณไนเทรตได้อย่างรวดเร็ว 1 โอโซเลตที่มีการลดลงอย่างช้า ๆ และ 11 ไอโซเลต ที่มีการสะสมไนไทรต์ จากการตรวจสอบยีนโดยเทคนิคพีซีอาร์ (PCR) พบว่ามี 9 ตัวอย่างที่มียีนเป็น nirKและ 4 ตัวอย่างที่มียีนเป็น nirS ส่วนอีก 3 ตัวอย่างไม่สามารถตรวจสอบยีนได้ ผลการวิเคราะห์อาร์เอฟแอลพีสามารถแบ่งกลุ่มแบคทีเรียที่มียีน nirKได้ 2 กลุ่มใหญ่ และยีน nirS ได้ 3 กลุ่ม ซึ่งสอดคล้องกับการจำแนกชนิดแบคทีเรียด้วยวิธีทางชีวเคมี