Please use this identifier to cite or link to this item:
https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/29163
| Title: | การผลิตกรด 12-คีโตคีโนดีออกซีโคลิก โดยการตรึงเซลล์ร่วมของเอสเคอริเคียโคไล HD-1 และซูโดโมนาส เทสโทสเทอโรไน (ATCC 11996) |
| Other Titles: | Production of 12-ketochenodeoxycholic acid by co-immobilized cells of escherichia colt HD-1 pseudomonas iestosteroni (ATTCC 11996) |
| Authors: | พิศมัย เปี่ยมทิพย์มนัส |
| Advisors: | สัณห์ พณิชยกุล |
| Other author: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. บัณฑิตวิทยาลัย |
| Issue Date: | 2530 |
| Publisher: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย |
| Abstract: | วัตถุประสงค์ของการวิจัยนี้เพื่อศึกษาศักยภาพของการผลิตกรด 12-คีโตคีโนดีออกซีโคลิก (12-ketochenodeoxycholic acid, 12-KCDCA) โดยใช้เซลล์ตรึงร่วมของเอสเคอริเคีย โคไล HD-1 (Escherichia coli HD-1) และซูโดโมนาส เทสโทสเทอโรไน (ATCC 11996) (Pseudomonas testosterone, ATCC 11996) ผลการวิจัยพบว่า E. coli สายพันธุ์ HD-1 สามารถผลิตเอนไซม์แอลฟา-ไฮดรอกซีสเตียรอยด์ดีไฮโดรจีเนส (𝛼-hydroxysteroid dehydrogenase, 𝛼-HSDH) ซึ่งมีแอคติวิตีต่อสับสเตรทกรดคีโนดีออกซีโคลิก (chenodeoxycholic acid, CDCA) สูงกว่ากรดลิโทโคลิก (lithocholic acid, LCA) ถึง 30 เท่า ผลการศึกษาชนิดของเอนไซม์ให้ผลยืนยันว่า เอนไซม์ที่ได้จาก E. coli ประกอบด้วย 7 แอลฟาไฮดรอกซีสเตียรอยด์ดีไฮโดรจีเนส (7𝛼-HSDH) และ 3 แอลฟา-ไฮดรอกซีสเตียรอยด์ดีไฮโดรจีเนส (3-HSDH) เมื่อเลี้ยง E. coli ในอาหารสูตร LB จะให้แอคติวิตีของเอนไซม์ 𝛼-HSDH ได้ค่อนข้างสูง (แอคติวิตีจำเพราะ 4.8 หน่วยต่อมก.โปรตีน, ใช้ CDCA เป็นสับสเตรท) การเสริม CDCA และ LCA (0.5 กรัมต่อลิตร) ไม่สามารถเหนี่ยวนำการสังเคราะห์เอนไซม์ 𝛼-HSDH ใน E. coli ได้ พีเอชที่เหมาะสมในการเร่งปฏิกิริยาดีไฮโดรจีเนชั่นของเอนไซม์ 𝛼-HSDH อยู่ในช่วง 9.5-10.0 ส่วนการเร่งปฏิกิริยาย้อนกลับ (ไฮโดรจีเนชั่น) จะเกิดได้ดีที่พีเอช 5.0 หลังจากเก็บรักษา 𝛼-HSDH ใน 0.1 โมลาร์ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ พีเอช 7.0 ที่มีกลีเซอรอล 10 เปอร์เซ็นต์ อุณหภูมิ 7 องศาเซลเซียส นาน 50 วัน จะเหลือแอคติวิตีของเอนไซม์อยู่ประมาณ 50 เปอร์เซ็นต์ นอกจากนี้ยังพบว่าแอคติวิตีของ 𝛼-HSDH ในเซลล์ E. coli จะลดลงประมาณ 40 เปอร์เซ็นต์ เมื่อเก็บเซลล์ไว้ในสารละลายนอร์มัลซาไลน์ที่อุณหภูมิ 7 องศาเซลเซียส นาน 70 วัน P. estosteroni (ATCC 11996) สามารถผลิตเอนไซม์ HSDH ได้ระดับต่ำ (แอคติวิตีจำเพาะสูงสุด 0.08 หน่วยต่อ มก. โปรตีน, ใช้โซเดียมโคเลทเป็นสับสเตรท) เมื่อเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อสูตร NB ผสมสารสกัดจากยีสต์ 2 เปอร์เซ็นต์ แอคติวิตีของเอนไซม์ HSDH ของ P. testosterone สามารถถูกเหนี่ยวนำให้สูงขึ้นประมาณ 9-10 เท่า (แอคติวิตีจำเพาะ 1.8 หน่วยต่อ มก.โปรตีน, ใช้โซเดียมโคเลทเป็นสับสเตรท) เมื่อเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อสูตร Marcus และ Talalay เสริมด้วยโซเดียมโคเลท (sodium cholate) กรดดีไฮโดรโคลิก (dehydrocholic acid, DHCA) หรือเทสโทนเทอโรน (testosterone) อย่างใดอย่างหนึ่ง เทียบกับแอคติวิตีในอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดเดียวกันที่ไม่ได้เสริม ผลการศึกษาชนิดของเอนไซม์ที่ผลิตโดย P. testosterone ให้ข้อสรุปว่า นอกจากเอนไซม์ 3 แอลฟา- และ 3 เบตา-ไฮดรอกซีสเตียรอยด์ดีไฮโดรจีเนส ซึ่งมีรายงานว่าพบในเซลล์ชนิดนี้แล้ว P. testosterone ยังสามารถผลิตเอนไซม์ซึ่งจำเพาะต่อหมู่ไฮดรอกซิลที่ตำแหน่งที่ 7 ของสารจำพวกกรดน้ำดีได้อีกด้วย พีเอชที่เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์ HSDH เมื่อเร่งปฏิกิริยาไฮโดรจีเนชั่น (DHCA เป็นสับสเตรท) คือ พีเอช 5.0 เอนไซม์ 3𝛼- และ 7𝛼-HSDH จะเร่งปฏิกิริยาดีไฮโดรจีเนชั่นได้ดีที่พีเอช 10.5 และ 11.0 เมื่อมี LCA และ CDCA เป็นสับสเตรท ตามลำดับ เซลล์ P. testosteroni ที่เก็บในสารละลายนอร์มัลซาไลน์ อุณหภูมิ 7 องศาเซลเซียส นาน 42 วัน จะเหลือแอคติวิตีของเอนไซม์สูงถึง 80 เปอร์เซ็นต์ แต่จำนวนเซลล์มีชีวิตจะมีค่าเพียง 30-40 เปอร์เซ็นต์ของเซลล์เริ่มต้น ในขณะที่แอคติวิตีของเอนไซม์ HSDH ซึ่งเก็บไว้ใน 0.1 โมลาร์ฟอสเฟตบัพเฟอร์ พีเอช 7.0 ที่มีกลีเซอรอล 10 เปอร์เซ็นต์ อุณหภูมิ 7 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 34 วัน จะลดลงเหลือเพียง 15 เปอร์เซ็นต์ เอนไซม์ไฮดรอกซีสเตียรอยด์ดีไฮโดรจีเนสจากเซลล์ P. testosteroni จะมีความเสถียรค่อนข้างสูงเมื่อเก็บอยู่ใน 0.1 โมลาร์อะซีเตทบัพเพอร์ พีเอช 6.0 ที่อุณหภูมิ 7 องศาเซลเซียส ที่อุณหภูมิ 50 องศาเซลเซียส เซลล์และเอนไซม์ 𝛼-HSDH ที่ได้จากเซลล์ E. coli จะมีความเสถียรสูงกว่าเซลล์และเอนไซม์ที่ได้จาก P. testosterone (เซลล์มีชีวิตลดลงเหลือ 30 และ 6 เปอร์เซ็นต์ ในขณะที่แอคติวิตีลดลงเหลือ 95 และ 30 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ เมื่อให้ความร้อนที่อุณหภูมินี้นาน 10 นาที) เอนไซม์ 𝛼-HSDH จาก E. coli จะเริ่มถูกยับยั้งเมื่อใช้ความเข้มข้นของโปแตสเซียมคลอไรด์สูงกว่า 0.1 โมลาร์ ในขณที่ความเข้มข้นสูงกว่า 0.1 โมลาร์ ของโปแตสเซียมคลอไรด์จะลดแอคติวิตีของเอนไซม์จาก P. testosterone ได้ประมาณ 30 เปอร์เซ็นต์ เมื่อศึกษาเปรียบเทียบศักยภาพของการสังเคราะห์กรด 12-คีโตคีโนดีออกซีโคลิก (12-KCDCA) จากการเปลี่ยนรูปสับสเตรทกรดดีไฮโดรโคลิก (DHCA) โดยใช้เซลล์อิสระและเซลล์ตรึงรูปของ E. coli และ P. testosterone ปรากฏว่า วิถีการสังเคราะห์ 12-KCDCA ด้วยเซลล์ E. coli อิสระ, เซลล์ตรึงด้วยแคปปาคาร์ราจีแนน-วุ้น (2.5 เปอร์เซ็นต์แคปปาคาร์ราจีแนน กับ 1.5 เปอร์เซ็นต์วุ้น) และเซลล์ตรึงด้วยแอลจิเนต (1 เปอร์เซ็นต์) จะเป็นแบบเดียวกัน คือ มีการสังเคราะห์ผลิตภัณฑ์ 12-KCDCA โดยผ่านสารตัวกลาง (intermediate) กรด 3,12-ไดคีโตลิโทโคลิก (3, 12-diketolithocholic acid) เสียก่อน เซลล์ E. coli อิสระ เมื่อมี 0.1 โมลาร์แคลเซียมคลอไรด์จะเร่งปฏิกิริยาการสังเคราะห์ผลิตภัณฑ์ 12-KCDCA ได้สูงกว่าเมื่อมี 0.05 โมลาร์โปแตสเซียมคลอไรด์ถึง 4 เท่า ในขณะที่เซลล์ E. coli ตรึงด้วยแคปปาคาร์ราจีแนน-วุ้น จะให้ผลผลิตของ 12-KCDCA ต่ำกว่าเมื่อใช้เซลล์ตรึงด้วยแอลจิเนตประมาณ 2-3 เท่า และปริมาณผลิตภัณฑ์ที่ได้เกือบไม่แปรผันตามความเข้มข้นของเซลล์ตรึง E. coli ที่ใช้เลย (5, 10 และ 20 เปอร์เซ็นต์ น้ำหนักเซลล์ต่อปริมาตร) อย่างไรก็ตาม ค่าผลิตภัณฑ์ของ 12-KCDCA ที่ได้จากการใช้เซลล์ตรึงแคปปาคาร์ราจีแนน-วุ้น ก็ยังมีค่าต่ำกว่าเมื่อใช้เซลล์อิสระประมาณ 3 เท่า เช่นกัน เซลล์ P. testosteroni อิสระสามารถเร่งปฏิกิริยาการเกิดผลิตภัณฑ์ 12-KCDCA ในสถาวะซึ่งมี 0.1 โมลาร์แคลเซียมคลอไรด์ได้สูงกว่าเมื่อมี 0.05 โมลาร์โปแตสเซียมคลอไรด์ ส่วนเซลล์ P. testosteroni ตรึงด้วยแคปปาคาร์ราจีแนน-วุ้น จะให้ปริมาณ 12-KCDCA ต่ำมากเมื่อเทียบกับเซลล์อิสระในปฏิกิริยาที่มี 0.05 โมลาร์โปแตสเซียมคลอไรด์เท่ากัน ความเข้มข้นของเซลล์ P. testosteroni (5 และ 10 เปอร์เซ็นต์น้ำหนักเซลล์ต่อปริมาตร) ตรึวด้วยแคปปาคาร์ราจีนแนน-วุ้น ไม่มีผลต่อปริมาณ 12-KCDCA ที่เกิดในปฏิกิริยา แต่ผลจะตรงข้ามหากตรึงเซลล์ด้วยแอลจิเนต เมื่อใช้เซลล์ P. testosteroni ตรึงด้วยแอลจิเนต ความเข้มข้นเซลล์ 20 เปอร์เซ็นต์ จะให้ผลผลิตของผลิตภัณฑ์ 12-KCDCA สูงกว่าเมื่อใช้ 5 และ 10 เปอร์เซ็นต์เซลล์ตรึงด้วยสารชนิดเดียวกันประมาณ 2 เท่า โดยไม่พบผลิตภัณฑ์ตัวกลางหรืออนุพันธ์กรดน้ำดีชนิดอื่นใดเกิดควบคู่ไปกับ 12-KCDCA เลย การใช้เซลล์อิสระและเซลล์ P. testosteroni ตรึงแอลจิเนตเปลี่ยนรูป DHCA ให้เป็น 12-KCDCA ในปฏิกิริยาที่มี 0.1 โมลาร์แคลเซียมคลอไรด์ จะปรากฏผลิตภัณฑ์กรดน้ำดีเพิ่มขึ้นจากเดิมอีก 2 ชนิด ซึ่งคาดว่าอาจเป็นกรด 7, 12-ไดคีโตลิโทโคลิก และ 3 เบตา, 7 แอลฟา, 12-คีโตโคลิก (3𝛽, 7𝛼, 12-ketocholic acid) เซลล์ P. testosteroni ตรึงด้วยแอลจิเนตสามารถสังเคราะห์ผลิตภัณฑ์ 12-KCDCA ได้โดยปราศจาก NADH จากแหล่งภายนอก (82 เปอร์เซ็นต์ของปริมาณซึ่งสังเคราะห์ได้เมื่อมี NADH 2.5 มิลลิโมลาร์) แคลเซียมคลอไรด์ความเข้มข้นต่ำ (0-0.1 โมลาร์) จะกระตุ้นการสังเคราะห์ผลิตภัณฑ์ 12-KCDCA แต่ที่ความเข้มข้นสูง (มากกว่า 0.1 โมลาร์) จะยับยั้งการสังเคราะห์ผลิตภัณฑ์ ทั้งนี้เป็นเพราะแคลเซียมคลอไรด์ยับยั้งการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ แอลฟาไฮดรอกซีสเตียรอนด์ดีไฮโดรจีเนส ที่ได้จาก E. coli และ P. testosterone ค่า Km ต่อกรดดีไฮโดรโคลิกในการผลิต 12-KCDCA มีค่า 1.0 มิลลิโมลาร์ และ 2.5 มิลลิโมลาร์ สำหรับเซลล์อิสระและเซลล์ P. testosteroni ตรึงด้วยแอลจิเนต ตามลำดับ ยิ่งไปกว่านั้นเซลล์ P. testosteroni ตรึงด้วยแอลจิเนตสามารถนำกลับมาใช้ใหม่อย่างต่อเนื่องได้ถึง 4 ครั้ง โดยไม่มีการสูญเสียความสามารถในการผลิต 12-KCDCA เลย ความเสถียรของเซลล์ตรึงเมื่อเก็บที่อุณหภูมิ 7 องศาเซลเซียส ในสารละลายนอร์มัลซาไลน์ ซึ่งมี 0.1 โมลาร์แคลเซียมคลอไรด์ นาน 7 วัน จะมีคุณสมบัติในการสังเคราะห์ 12-KCDCA อยู่ถึง 50 เปอร์เซ็นต์ |
| Other Abstract: | The aim of this research is to study the potential of 12-ketochenodeoxycholic acid (12-KCDCA) production by co-immobilized cells of Escherichia coli HD-1 and Pseudomonas testosteroni (ATCC 11996). The results revealed that our strain of E. coli HD-1 was able to synthesize 𝛼-hydroxysteroid dehydrogenase (𝛼-HSDH). The enzyme activity when chenodeoxycholic acid (CDCA) used as the substrate was 30 times higher than that obtained when lithocholic acid (LCA) was used. The enzymes extracted from E. coli consisted of 7𝛼-hydroxysteroid dyhydrogenase (7𝛼-HSDH) and 3𝛼-hydrocysteroid dehydrogenase (𝛼-HSCH). E. coli grown in LB medium would yield rather high activity of 𝛼-HSDH (specificity activity 4.8 units/mg protein using CDCA as a substrate.) The supplement of CDCA and LCA (0.5 g/l) could not induce 𝛼-HSDH synthesis in E. coli. 𝛼-HSDH had an optimum pH of 9.5-10.0 in the dehydrogenation system and 5.0 for the hydrogenation reaction. The remaining activity of 𝛼-HSDH after 50 days storage at 7℃ in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.0 consisting of 10% glycerol was 50 percent. Additionally, it was found that the activity of 𝛼-HSDH in E. coli cells decreased about 40 percent when stored in normal saline at 7℃ for 70 days. P. testosteroni (ATCC 11996) could produce HSDH at low level (maximal specific activity 0.08 unit/mg protein, using sodium cholate as a substrate) in nutrient broth plus 2% yeast extract. The activity of HSDH of P. testosteroni could be induced higher by 9-10 times (specific activity 1.8 unit/mg protein using sodium cholate as a substrate) when grown in Marcus and Talalay media supplemented with either sodium cholate, dehydrocholic acid (DHCA) or testosterone comparing to the activity in the same medium but without any supplement. The studies of types of enzyme produced by P. testosteroni concluded that besides 3𝛼- and 7𝛽-hydroxy steroid dehydrogenase which had been reported that they were found, P. testosteroni was also able to produce enzyme specific to hydroxyl group at 7 th position of bile acids. The optimal pH of HSDH in the hydrogenation direction (using DHCA as a substrate) was 5.0. The pH of 10.5 and 11.0 were the optimal pH for 3𝛼 - and 7𝛼 -HSDH to catalyse the dehydrogenation reaction when having LCA and CDCA as substrates, respectively. The remaining enzyme activity of P. testosteroni stored in normal saline at 7℃ for 42 days was as high as 80 percent but the number of viable cells was only about 30-40 percent compared to the initial value; whereas when HSDH stored in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.0 (containing 10% glycerol) at 7℃ for 34 days, the enzyme activity was left only 15 percent. The stability of hydroxysteroid dehydrogenase from P. testosteroni was rather high when kept in 0.1 M acetate buffer, pH 6.0, at 7℃ . Futhermore, at 50℃ , the stability of cells and 𝛼-HSDH of E. coli were higher than that of P. testosteroni (viable cells remained 30 and 6 percent while activity remained 95 and 30 percent, respectively) when maintained at this temperature for 10 minutes. The inhibitory effect of 𝛼-HSDH from E. coli started when the concentration of potassium chloride was higher that 0.1 M. The enzyme activity from P. testosteroni decreased about 30 percent when the concentration of potassium chloride used was higher than 0.1 M. The potential of the transformation of dehydrocholic acid (DHCA) to 12-ketochenodeoxycholic acid (12-KCDCA) was compared between free cells and immobilized cells of E. coli and P. testosteroni. The results showed that E coli free cells, kappa carrageenan-agar (2.5% kappa carrageenan plus 1.5% agar) immobilized cells and alginate (1%) immobilized cells had same pattern of 12-KCDCA biosynthetic pathway via the intermediate of 3, 12-diketolithocholic acid. The catalytic activity of E. coli free cells in the 12-KCDCA production when containing 0.1 M calcium chloride in the reaction was 4 times higher than when containing 0.05 M potassium chloride. On the contrary, kappa carrageenan-agar immobilized E. coli cells produced 12-KCDCA about 2-3 times lower than the alginate immobilized cells. The amount of this product was rather constant at the various concentration of E. coli cells (5, 10 and 20% W/V). Nevertheless, the 12-KCDCA synthesized by kappa carrageenan-agar immobilized cells was still 3 times lower than by free cells. P. testosteroni free cells could produce higher level of 12-KCDCA in the presence of 0.1 M calcium chloride than 0.05 M potassium chloride. At the same potassium chloride concentration, P. testosteroni immobilized with kappa carrageenan-agar synthesized very low amount of 12- KCDCA in comparison to free cells. The concentration of P. testosteroni immobilized cells with kappa carraneenan-agar (5 and 10% W/V) had no effect on the production of 12-KCDCA but the opposite results obtained when using alginate immobilized cells. The value of 12-KCDCA obtained when using 20% cells of alginate immobilized P. testosteroni was 2 folds higher than 5 and 10% immobilized cells without any appearance in bile acid derivatives. The transformation reaction of DHCA to 12-KCDCA in the presence of 0.1 M Calcium chloride was observed 2 additional bile acids when using free cells and alginate immobilized P. testosteroni. They were suggested to be 7, 12-diketolithocholic acid and 3𝛽, 7𝛼, 12-ketocholic acid. Without exogeneous NADH, alginate immobilized P. testosteroni cells could transform DHCA to 12-KCDCA with 82 percent of the same reaction adding 2.5 mM NADH. The activation of 12-KCDCA production was demonstrated at lower concentration of calcium chloride (0-0.1 M). The concentration of calcium chloride higher than 0.2 M remarkedly inhibited the product formation due to the action on enzyme 𝛼-HSDH in both E. coli and P. testosteroni. The Km for the transformation of dehydrocholic acid to 12-KCDCA were found to be 1.0 mM and 2.5 mM for free P. testosteroni cells and the alginate immobilized cells, respectively. Moreover, the alginate immobilized P. testosteroni could be reused continuously for 4 times without any loss of the ability to produce 12-KCDCA. The stability of P. testosteroni immobilized by alginate was considerably high with the 50% remaining activity of the 12-KCDCA synthesis after kept in normal saline solution containing 0.1 M calcium chloride at 7 ℃ for 7 days. |
| Description: | วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2530 |
| Degree Name: | วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต |
| Degree Level: | ปริญญาโท |
| Degree Discipline: | เทคโนโลยีชีวภาพ |
| URI: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/29163 |
| ISBN: | 9745682098 |
| Type: | Thesis |
| Appears in Collections: | Grad - Theses |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| Pismai_pi_front.pdf | 11.9 MB | Adobe PDF | View/Open | |
| Pismai_pi_ch1.pdf | 4.09 MB | Adobe PDF | View/Open | |
| Pismai_pi_ch2.pdf | 6.18 MB | Adobe PDF | View/Open | |
| Pismai_pi_ch3.pdf | 35.45 MB | Adobe PDF | View/Open | |
| Pismai_pi_ch4.pdf | 16.04 MB | Adobe PDF | View/Open | |
| Pismai_pi_back.pdf | 10.95 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.