การตรวจสอบการแสดงออกของยีนไทโรซิเนสในเห็ดยานางิ Agrocybe cylindracea โดยวิธีอิเล็คโตรเคมิคอลไบโอเซ็นเซอร์

Abstract

วัตถุประสงค์ในการศึกษาวิจัยเรื่องนี้เพื่อต้องการพัฒนาวิธีการตรวจสอบการแสดงของยีนไทโรซิเนสและศึกษารูปแบบการแสดงออกของยีนนี้ในระหว่างการเสื่อมสภาพของเห็นยานางิ วิธีการศึกษาวิจัยเริ่มจากการออกแบบไพรเอมร์บนพื้นฐานข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนไทโรซิเนสที่พบในเห็ดราต่างชนิด และระบบการตรวจสอบดดยวิธี reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) ผลการศึกษาวิจัย พบว่าสามารถออกแบบไพรเมอร์ที่เหมาะสมเฉพาะเจาะจงต่อยีนไทโรซิเนสจากบริเวณลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เหมือนกับของเห็ด 2 ชนิด ได้แก่ เห็ดกระดุม Agaricus bisporus (Lange) Imbach และเห็ดหอม Lentinus edodes (Berk.) Sing. เมื่อนำไปตรวจสอบด้วยการเปรียบเทียบในรูปแบบ Local alignment (BLAST n) พบความจำเพาะเจาะจงต่อยีนไทโรซิเนสในเห็ดกระดุมและเห็ดหอมอย่างชัดเจนที่ความเหมือน 100 เปอร์เซ็นต์ไพรเมอร์ที่ได้นำไปประยุกต์ในการศึกษาการแสดงออกของยีนดังกล่าวด้วเยทคนิค RT-PCR ได้ผลิตภัณฑ์ cDNA ขนาด 700 นิวคลีโอไทด์ ซึ่งมีลำดับนิวคลีโอไทด์สอดคล้องกับไทโรซิเนสที่พบในเห็ดชนิดอื่น หลังตรวจสอบโดยการโคลน หาลำดับนิวคลีโอไทด์และเปรียบเทียบลำดับนิวคลีโอไทด์ การตรวจสอบการแสดงออกของยีนสามารถแบ่งการแสดงออกได้ 6 ระยะ โดยตรวจสอบการแสดงออกของยีนด้วยเทคนิคไบโอเซ็นเซอร์ทางเคมีไฟฟ้า (electrochemical DNA biosensor) โดยใช้โมเลกุล Hoechst 33258 เป็นโมเลกุลกลางในการชักนำให้เกิดการเปลี่ยนสัญญาณ cDNA พบว่า การแสดงออกของยีนในครีบในระยะที่ 1 และสะสมมากขึ้นเรื่อย ๆ จีนถึงระยะที่ 6 ขณะที่รูปแบบการแสดงออกของยีนในวงแหวนสูงสุดในระยะที่ 3 ส่วนผลการแสดงออกของยีนเมื่อเปรียบเทียบรูปการแสดงออกของยีนกับ 12S rRNA พบว่า การแสดงในครีบสูงสุดที่ระยะ 6 คิดเป็น 2.67 เปอร์เซ็นต์ของการแสดงออกของ 12S rRNA และการแสดงออกในวงแหวนสูงสุดในระยะที่ 3 คิดเป็น 1.38 เปอร์เซ็น ซึ่งสอดคล้องกับรูปแบบการแสดงออกที่แสดงในแถบ cDNA ที่ตรวจสอบโดยการแยกเจลอิเล็คโทรฟอเริซส สำหรับผลการศึกษา รูปแบบการแสดงออกของยีนมีความสอดคล้องกับการพัฒนาการทางสรีรวิทยาที่เข้าสู่การเสื่อมของดอกเห็ด ซึ่งเป็นประโยบน์ในการศึกษาพื้นฐานการเปลี่ยนแปลงสีของดอกในเห็ดยานางิต่อไป