การพัฒนาระบบขนถ่ายดีเอ็นเอโดยใช้อนุภาคนาโนไคโทซานและการเหนี่ยวนำให้เกิดกระบวนการออโต้ฟาจีในเซลล์นำเสนอแอนติเจน : โครงการวิจัย

Abstract

การทรานสเฟคชันโดยการนำพลาสมิดที่มีชิ้นยีนแทรกสอดเข้าสู่เซลล์เป็นขั้นตอนสำคัญในการประยุกต์ใช้งานด้านชีวเวชศาสตร์ เช่น การทำยีนบำบัด และวัคซีนชนิดดีเอ็นเอ เซลล์ส่วนใหญ่รับพลาสมิดเข้าสู่เซลล์ด้วยประสิทธิภาพที่ต่างกัน เซลล์นำเสนอแอนติเจน (Antigen Presenting Cell; APC) เช่น เซลล์เดนไดรติกและแมโครฟาจ เป็นหนึ่งในเซลล์ที่นำพลาสมิดเข้าสู่เซลล์ได้ยากที่สุด เซลล์เหล่านี้มีบทบาทสำคัญในการนำเสนอแอนติเจนต่อเฮลเปอร์ทีลิมโฟไซต์เพื่อชักนำให้มีการตอบสนองแบบ adaptive อย่างมีประสิทธิภาพ ในการที่จะกระตุ้นภูมิคุ้มกันได้อย่างมีประสิทธิภาพหลังจากการปลูกวัคซีนนั้น สามารถที่จะมุ่งเป้าแอนติเจนไปยังเซลล์นำเสนอแอนติเจน วัคซีนชนิดดีเอ็นเอเป็นวัคซีนชนิดใหม่ที่มีศักยภาพที่จะทดแทนวัคซีนที่มีใช้อยู่ในปัจจุบันได้ จากเหตุผลในด้านความง่ายในการเตรียม ความเสถียรและราคาต้นทุนที่ถูก โดยทั่วไปวัคซีนชนิดดีเอ็นเอจะให้ทาง intradermal หรือ intramuscular และเชื่อกันว่าเซลล์ใด ๆ ก็สามารถนำพลาสมิดเข้าสู่เซลล์ได้ การมุ่งเป้าวัคซีนชนิดดีเอ็นเอไปยังเซลล์จำเพาะชนิดแบบจำเพาะนั้นเป็นสิ่งที่พึงประสงค์ในการเหนี่ยวนำการตอบสนองของภูมิคุ้มกันที่ดีที่สุด ออโต้ฟาจีเป็นกลไกป้องกันการรุกรานของเชื้อก่อโรคในระดับเซลล์โดยจะกำจัดแอนติเจนภายในเซลล์ รวมถึงเชื้อก่อโรคแอนติเจนที่เป็นโปรตีนที่ผ่านการย่อยจะถูกนำเสนอแก่เฮลเปอร์ทีลิมโฟไซต์ ดังนั้น ในงานวิจัยนี้ผู้วิจัยจึงมีวัตถุประสงค์ในการพัฒนาระบบนำส่งดีเอ็นเอพลาสมิดที่มุ่งเป้าไปยัง APC โดยใช้อนุภาคนาโนจากไคโทซานและผนวกระบบการเหนี่ยวนำออโต้ฟาจีเมื่อให้นำส่งดีเอ็นเอแล้วโดยใช้พลาสมิดเหนี่ยวนำออโต้ฟาจี ก่อนอื่นผู้วิจัยได้หาภาวะที่เหมาะสมในการทรานสเฟคชันโดยใช้ไคโทซานละลายได้ในกรดในการห่อหุ้มพลาสมิดในระดับ in vitro ที่สัดส่วน N/P ที่ 8:1-10:1 ให้อัตราการทรานสเฟคชันเข้าเซลล์สูงสุดใน HEK293T ผู้วิจัยได้ดัดแปรไคโทชานให้มี strepavidin และใช้ในการห่อหุ้มพลาสมิด หลังจากนั้นนำไคโทซาน strepavidin-พลาสมิดไปบ่มกับ biotinylated anti-F4/80 antibody ซึ่งจำเพาะต่อโมเลกุลบนผิวเซลล์แมโครฟาจ ซึ่งพบว่าไคโทซานดัดแปรนี้มีบ่มร่วมกับ biotinylated anti-F4/80 antibody ไม่สามารถเพิ่มอัตราการทรานสเฟคชัยเข้าเซลล์ไลน์แมโครฟาจ RAW264.7 ได้ การศึกษานี้จึงบ่งชี้ว่าจำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อหาภาวะที่เหมาะสมในการใช้ไคโทซานดัดแปรให้มี strepavidin เพื่อนำส่งแบบมุ่งเป้าดีเอ็นเอไปยังเซลล์เป้าหมาย อีกทั้งเพื่อเพิ่มการนำเสนอแอนติเจนต่อทีลิมโฟไซต์ผู้วิจัยจึงได้พัฒนาระบบพลาสมิดที่เหนี่ยวนำให้เซลล์เกิดออโต้ฟาจี จากการใช้พลาสมิดที่มียีน mTOR ที่มีการกลายพันธุ์ที่ทำให้ไคเนสของ mTOR เสียแอคติวิตี พบว่าสามารถตรวจหาการเกิดออโต้ฟาจีใน HEK293T และเซลล์ไลน์เดนไดรติก JAWSII ได้ ดังนั้น ระบบการเหนี่ยวนำออโต้ฟาจีจึงได้มีการพัฒนาขึ้น ดังนั้น จึงเป็นไปได้ว่าสามารถใช้วัคซีนชนิดดีเอ็นเอในการกระตุ้นการตอบสนองของภูมิคุ้มกันที่แรงโดยการนำเทคนิคนี้มาใช้ร่วมกัน