Please use this identifier to cite or link to this item:
https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/59398
| Title: | การผลิตรีคอมบิแนนต์โปรตีนจากบางส่วนของยีนยูนีคซ๊อต 8 ของไวรัสพิษสุนัขบ้าเทียม |
| Other Titles: | The production of recombinant protein from a partial of pseudorabies virus unique short 8 gene |
| Authors: | ศุภฤกษ์ นันทวัน ณ อยุธยา |
| Advisors: | รุ่งโรจน์ ธนาวงษ์นุเวช |
| Other author: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. คณะสัตวแพทยศาสตร์ |
| Advisor's Email: | Roongroje.T@Chula.ac.th |
| Subjects: | สุกร -- โรคเกิดจากไวรัส โรคกลัวน้ำ วัคซีนสัตว์ Swine -- Virus diseases Rabies Veterinary vaccines |
| Issue Date: | 2553 |
| Publisher: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย |
| Abstract: | โรคพิษสุนัขบ้าเทียมเป็นโรคประจำถิ่นของประเทศไทย และก่อความเสียหายให้แก่อุตสาหกรรรมการเลี้ยงสุกรของประเทศไทยอยู่เป็นระยะๆ การศึกษาในครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อผลิตโปรตีนจากยีนยูนีคซ๊อต 8 ของไวรัสพิษสุนัขบ้าเทียมเพื่อนำไปพัฒนาเป็นชุดทดสอบโรคพิษสุนัขบ้าเทียมชนิดอิมมูนโนโครมาโตกราฟฟิก โดยการศึกษานี้ใช้ไวรัสพิษสุนัขบ้าเทียมสายพันธุ์ 8NP74 นำมาเพิ่มจำนวนดีเอนเอที่ตำแหน่งนิวคลีโอไทด์ที่ 156 ถึง 714 ของยีนยูนีคช๊อต 8 ด้วยปฎิกริยาลูกโซ่โพลิเมอร์เรส นำผลผลิต gE fragment (ขนาด 573 คู่เบส) ดังกล่าวไปโคลนเข้าพลาสมิด pGEM-Teasy ให้ชื่อเป็น พลาสมิด gE pGEM-T แล้วใส่เข้าไปในแบคทีเรียอีโคไลสายพันธุ์ JM109 ทำการเพิ่มจำนวนแบคทีเรียแล้วสกัดพลาสมิด gE pGEM-T ออกมาจากแบคทีเรีย และทำการตัดด้วยเอนไซม์ EcoRI ก่อนทำการเชื่อมต่อส่วนของยีนยูนีคซ๊อต 8 ที่ถูกตัดออกมาเข้าสู่พลาสมิด pGEX 5x-3 ซึ่งใช้เป็น expression vector โดยใช้แบคทีเรียอีโคไลสายพันธุ์ Rosetta DE3 plysS เป็นแบคทีเรียที่ทำหน้าที่ผลิตรีคอมบิแนนท์โปรตีน ตรวจสอบความถูกต้องของลำดับนิวคลีโอไทด์ก่อนทำการกระตุ้นแบคทีเรียให้ทำการสร้างรีคอมบิแนนท์โปรตีน gE นำรีคอมบิแนนท์โปรตีนที่ผลิตได้ไปทดสอบ Western immunoblotting analysis โดยใช้ซีรัมสุกรที่ให้ผลบวกกับไวรัสพิษสุนัขบ้าเทียมด้วยวิธีอีไลซา (HerdCheck Anti-ADV gpI, IDEXX, USA) และนำไปเปรียบเทียบกับโปรตีนที่สกัดจากแบคทีเรียควบคุม พบการติดสีน้ำตาลที่แถบโปรตีนขนาดประมาณ 47 กิโลดาลตัน นำโปรตีนที่ได้ไปทดสอบ Dot blot analysis พบว่าสามารถทำปฎิกริยากับซีรัมสุกรที่ให้ผลบวกกับไวรัสพิษสุนัขบ้าเทียมด้วยวิธีอีไลซาได้ จากการศึกษาในครั้งนี้สามารถผลิตรีคอมบิแนนท์โปรตีน gE จากยีนยูนีคซ๊อต 8 ได้และมีความเป็นไปได้ที่จะสามารถนำไปพัฒนาเป็นชุดทดสอบโรคพิษสุนัขบ้าเทียมชนิดอิมมูโนโครมาโตกราฟฟิกได้ |
| Other Abstract: | Aujeszky’s disease or Pseudorabies is an endemic disease causing economic losses to the Thai swine industries. The objective of this study is to produce recombinant protein from unique short 8 gene (Us 8) of pseudorabies virus and to develop immunochromatographic strip test for detecting pseudorabies–infected pigs. Nucleotides 156 to 174 of a wild type pseudorabies virus (8NP74) Us 8 gene were amplified by using polymerase chain reaction (PCR) and the PCR product was cloned into pGEM-Teasy plasmid and named gE pGEM-T. This plasmid was transformed into E. coli JM109 strain. After culturing, gE pGEM-T plasmid was extracted and cut with enzyme EcoRI. The cut sequence was cloned into pGEX 5x-3 expression vector. E. coli rosetta DE3 plysS was used for producing gE recombinant protein. Nucleotide sequence was again checked before gE recombinant protein production. Recombinant protein was tested by western immunoblotting analysis using known ELISA positive swine serum (HerdCheck Anti-ADV gpI, IDEXX, USA) and compared to the protein from the control bacteria. The result showed reaction at protein size around 47 kDa. Recombinant protein was purified and tested using dot blot analysis. Positive reaction to known pseudorabies positive serum was demonstrated. From this study, gE recombinant protein was successfully produced using E. coli and potentially used for pseudorabies virus immunochromatographic test development. |
| Description: | วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2553 |
| Degree Name: | วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต |
| Degree Level: | ปริญญาโท |
| Degree Discipline: | พยาธิชีววิทยาทางสัตวแพทย์ |
| URI: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/59398 |
| URI: | http://doi.org/10.14457/CU.the.2010.1602 |
| metadata.dc.identifier.DOI: | 10.14457/CU.the.2010.1602 |
| Type: | Thesis |
| Appears in Collections: | Vet - Theses |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| Suparlark Nuntawan Na Ayudhya .pdf | 1.65 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.