ผลกระทบของการต้านไพริเมธามีนต่อการนำเข้าของไพริเมธามีน และเอนไซม์บางตัวในโฟเลตเมตาบอลิสมของพลาสโมเดียม ชาบอดี

Abstract

ในงานวิจัยนี้ได้ศึกษากลไกการต้านไพริเมธามีนใน พลาสโมเดียม ชาบอดี โดยอาศัยเชื้อ 2 โคลนเป็นแม่แบบ คือ โคลน AS จัดเป็นเชื้อไม่ต้านยา (ไวต่อไพริเมธามีน 15 มิลลิกรัมต่อกิโลกรัมน้ำหนักตัว) และโคลน AS(Pr1) จัดเป็นเชื้อต้านยา (ไวต่อไพริเมธามีน 30 มิลลิกรัมต่อกิโลกรัมน้ำหนักตัว) เมื่อเปรียบเทียบขบวนการนำไพริเมธามีนเข้าสู่เซลล์เม็ดเลือดแดงหนูไมซ์ปกติ เม็ดเลือดแดงติดเชื้อ พลาสโมเดียม ชาบอดี ที่ต้านและไม่ต้านไพริเมธามีนโดยใช้สารกัมมันตรังสี 14C-pyrimethamine ข้อมูลเบื้องต้นบ่งชี้ว่า การนำเข้าของไพริเมธามีนจะช้าสุดในเซลล์เม็ดเลือดแดงติดเชื้อ พลาสโมเดียม ชาบอดี AS (Pr1) เมื่ออินคิวเบตเซลล์กับ 14C-pyrimethamine ความเข้มข้น 30 นาโนโมลาร์ในฮีพส์บัฟเฟอร์ซาลีน pH 7.4 ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาที และสกัด 14C-pyrimethamine ที่ถูกนำเข้าเซลล์ด้วยเอทธานอล ปรากฏว่าปริมาณสมบูรณ์ของ 14C-pyrimethamine ในเซลล์เม็ดเลือดแดงติดเชื้อโคลน AS , AS(Pr1) และเซลล์ที่ไม่ติดเชื้อจะมีค่าประมาณ 12.0 , 4.9 และ 1.3 พิโคโมลต่อ 10 9 เซลล์ตามลำดับ เซลล์เม็ดเลือดแดงปกติจะนำไพริเมธามีนเข้าเซลล์ด้วยขบวนการที่อิ่มตัว (Km 7.9 ± 0.1 นาโนโมลาร์) ซึ่งแสดงถึงว่า ไพริเมธามีนน่าจะถูกนำเข้าเซลล์ด้วยขบวนการ carrier-mediated transport แม้ว่าค่าการนำเข้าจะต่ำมากจนไม่สามารถสังเกตความแตกต่างเนื่องจากผลกระทบของอุณหภูมิและ pH ก็ตาม ลักษณะการนำเข้าของไพริเมธามีนโดยเซลล์ติดเชื้อ พลาสโมเดียม ชาบอดี AS จะแปรตาม pH และ อุณหภูมิ โดยที่ไพริเมธามีนจะยังคงผ่านเข้าเซลล์ได้ค่อนข้างดีเช่นกันที่อุณหภูมิต่ำๆ เมื่อพิจารณารวมไปถึงรูปแบบของการนำเข้า ซึ่งแปรตามความเข้มข้นของ 14C-pyrimethamine บ้างเล็กน้อย จึงเป็นไปได้ว่า ไพริเมธามีนน่าจะถูกนำเข้าเซลล์เม็ดเลือดแดงติดเชื้อโคลน AS โดยอาศัยขบวนการ carrier- mediated transport (Km 3.9±0.7 นาโนโมลาร์ ) ร่วมกับ simple diffusion ลักษณะการนำเข้าแบบ simple diffusion ของไพริเมธามีนนี้จะเห็นเด่นชัดมากขึ้นในเซลล์เม็ดเลือดแดงติดเชื้อ พลาสโมเดียม ชาบอดี AS(PR1) โดยที่การนำเข้าจะไม่ขึ้นกับอุณหภูมิ อย่างไรก็ตามข้อมูลจากการทดลองที่แสดงว่า การนำเข้าแปรตาม pH ซึ่งใช้ทดลอง และรูปแบบของการนำเข้า ไม่แปรตามความเข้มข้นของ 14C-pyrimethamine มากนัก (Km 6.3 ±0.9 นาโนโมลาร์) จึงอาจกล่าวได้ว่า carrier-mediated transport ของไพริเมธามีนยังคงปรากฏอยู่ในเซลล์ติดเชื้อโคลน AS(Pr1) แต่จะมีลักษณะแตกต่างจากขบวนการเดียวกันในเซลล์เม็ดเลือดแดงติดเชื้อ พลาสโมเดียม ชาบอดี AS ไปบ้าง ทั้งนี้ผลการทดลองพบว่า pH และกรดโฟลิคจะมีผลกระทบต่อการนำเข้าของไพริเมธามีนต่างกันอย่างเห็นได้ชัด เมื่อทำการศึกษาเซลล์ติดเชื้อทั้งสองโคลนในสภาวะที่ขาดอาหารยังพบอีกว่า การนำเข้าของไพริเมธามีนในเซลล์เม็ดเลือดแดงติดเชื้อจะขึ้นกับความเข้มข้นของกลูโคสและชนิดของสารที่เป็นแหล่งพลังงาน กับทั้งถูกยับยั้งได้ด้วย 2.4 - ไดไนโตรพีนอล แสดงผลสรุปถึงความเป็นไปได้ที่การนำเข้าของไพริเมธามีนในเซลล์เม็ดเลือดแดงหนูไมซ์ติดเชื้อ พลาสโมเดียม ชาบอดี จะอาศัยพลังงานบางส่วนโดยผ่านทางขบวนการออกซิเดทีฟฟอสฟอริลเลชัน ผลการศึกษาเปรียบเทียบเอนไซม์ 3 ตัวในโฟเลตเมตาบอลิสมของเชื้อทั้งสองโคลนโดยใช้เอนไซม์ที่ไม่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์ซึ่งเตรียมได้จากเซลล์อิสระของ พลาสโมเดียม ชาบอดี ซึ่งแยกออกจากเซลล์ติดเชื้อโดยการทำลายเยื่อเซลล์ติดเชื้อด้วย 0.015 เปอร์เซนต์ซาโปนินนาน 10 นาที พบว่า คุณสมบัติทางชีวเคมีและจลน์ศาสตร์ของเอนไซม์ไดไฮโดรโฟเลต รีดักเตส จากเชื้อต้านยา (โคลน AS (Pr1)) จะแตกต่างจากเชื้อไม่ต้านยา (โคลน AS ) หลายประการ ดังนี้ ค่ายับยั้ง 50 เปอร์เซนต์ของไพริเมธามีนต่อแอคติวิตีของเอนไซม์เพิ่มขึ้นประมาณ 9 เท่าในเชื้อโคลน AS(Pr1) (ED50 288.4 นาโนโมลาร์) เมื่อเทียบกับโคลน AS(ED50 33.1 นาโนโมลาร์) และไพริเมธามีนจะยับยั้งเอนไซม์ในพลาสโมเดียม ชาบอดี AS (Pr1) แบบ non –stoichiometric ส่วนเอนไซม์เดียวกันในพลาสโมเดียม ชาบอดี AS การยับยั้งจะเป็นแบบ stoichiometric จากการศึกษาค่าคงที่ทางจลน์ศาสตร์ของการยับยั้ง (Ki) แสดงว่า เอนไซม์ไดไฮโดรโฟเลต รีดักเตส จากพลาสโมเดียม ชาบอดี AS(Pr1) (Ki 160 นาโนโมลาร์) จะจับกับไพริเมธามีนได้เลวกว่าเอนไซม์จากเชื้อไม่ต้านยาประมาณ 5.5 เท่า (Ki 30 นาโนโมลาร์) โดยที่จลน์ศาสตร์การยับยั้งของไพริเมธามีนต่อเอนไซม์ในเชื้อโคลน AS (pr1) และ AS จะเป็นแบบแข่งขันและไม่แข่งขันตามลำดับ นอกจากนี้ยังพบว่า เอนไซม์จากโคลน AS(Pr1) สามารถจับกับลับสเตรตไดไฮโดรโฟเลต (Km 11.8±0.7 ไมโครโมลาร์) ได้ดีกว่าเอนไซม์เดียวกันของเชื้อโคลน AS (Km 44.9±0.6 ไมโครโมลาร์) แอคติวิตีของไดไฮโดรโฟเลต รีดักเตสที่สกัดจากเชื้อไม่ต้านไพริเมธามีนจะถูกกระตุ้นโดยโปแตสเซียมคลอไรด์ 0.05 โมลาร์ ในขณะที่เอนไซม์ต้านยาไม่ต้องการโปแตสเซียมคลอไรด์เป็นโคแฟคเตอร์ อุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ที่แยกจากเชื้อโคลน AS(Pr1) มีค่า 45-50 องศาเซลเซียส ซึ่งสูงกว่าค่าที่ได้จากเอนไซม์ในพลาสโมเดียม ชาบอดี AS ประมาณ 10 องศาเซลเซียส และเอนไซม์จากทั้งสองแหล่งจะถูกผลกระทบจาก pH คล้ายคลึงกันโดย pH ที่เหมาะสมสำหรับการวัดแอคติวิตีของเอนไซม์อยู่ที่ประมาณ pH 5.9 ต่างกันเล็กน้อยตรงเอนไซม์ในเชื้อต้านยาถูกยับยั้งได้ด้วยทริสบัฟเฟอร์ นอกจากนี้ค่าแอคติวิตีสุทธิสูงสุดต่อ 109 เซลล์แสดงให้เห็นว่า การต้านไพริเมธามีนของเชื้อ พลาสโมเดียม ชาบอดี AS (Pr1) จะปรากฏควบคู่กับการเพิ่มแอคติวิตีสุทธิสูงสุดของเอนไซม์ไดไฮโดรโฟเลต รีดักเตส (34.8±0.6 หน่วย) ขึ้นมากกว่าเชื้อโคลน AS ( 9.3±0.2 หน่วย) เกือบ 4 เท่า การศึกษาเปรียบเทียบเอนไซม์เซอรีน ไฮดรอกซีเมทธิลทรานสเฟอเรสซึ่งสกัดจาก พลาสโมเดียม ชาบอดี ทั้งสองโคลน พบว่า PH ที่เหมาะสมต่อการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ต่างก็จะเป็นช่วงกว้างโดยมีค่ากึ่งกลางที่ pH 8.4 และอุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับวัดแอคติวิตีของเอนไซม์ในโคลน AS คือ 50 องศาเซลเซียส ในขณะที่เชื้อโคลน AS(Pr1) พบว่าเอนไซม์จะเร่งปฏิกิริยาได้ดีที่อุณหภูมิ 50-55 องศาเซลเซียส นอกจากนี้พบว่าค่าคงที่ทางจลน์ศาสตร์ในการจับกันระหว่างเอนไซม์กับลับสเตรตจะไม่ต่างกันในเชื้อ พลาสโมเดียม ชาบอดี AS และ AS(Pr1) สำหรับการเปรียบเทียบแอคติวิตีสุทธิสูงสุดของเอนไซม์เซอรีน ไฮดรอกซีเมทธิลทรานสเฟอเรสต่อ 109 เซลล์ ปรากฏว่าในเชื้อต้านไพริเมธามีนจะวัดค่าได้มากกว่าเชื้อไม่ต้านเล็กน้อย และยังพบอีกว่าไพริเมธามีนความเข้มข้นสูงถึง 1.11 มิลลิโมลาร์ (ครึ่งหนึ่งของความเข้มข้นของ THF) จะไม่มีผลยับยั้งแอคติวิตีของเอนไซม์เซอรีน ไฮดรอกซีเมทธิลทรานสเฟอเรสแต่อย่างใด เมื่อศึกษาเปรียบเทียบเอนไซม์ในโฟเลตเมตาบอลิสมอีกตัวหนึ่งคือ ไดไฮโดรพเทอโรเอต ซินเตส พบว่า แอคติวิตีของเอนไซม์ซึ่งสกัดจากเชื้อพลาสโมเดียมที่ต้านไพริเมธามีนจะถูกกระตุ้นด้วยแมกนีเซียมคลอไรด์ความเข้มข้น 0.2 โมลาร์ ซึ่งไม่ต่างจากเอนไซม์ใน พลาสโมเดียม ชาบอดี AS และ pH จะมีผลกระทบคล้ายคลึงกันต่อเอนไซม์ของทั้งสองโคลน (pH ที่เหมาะสมต่อการวัดแอคติวิตีประมาณ 8.9 – 9.0) อุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ไดไฮโรพเทอโรเอต ซินเตส ที่แยกจาก พลาสโมเดียม ชาบอดี AS มีค่าระหว่าง 40 – 45 องศาเซลเซียส แต่จะมีค่า 45 องศาเซลเซียสสำหรับเอนไซม์เดียวกันใน พลาสโมเดียม ชาบอดี AS (Pr1) ข้อมูลการศึกษาทางจลน์ศาสตร์ให้ผลพอสรุปได้ว่าความสามารถของเอนไซม์จากเชื้อทั้งสองโคลนต่อการจับกับลับสเตรต (PABA และ DHPP) มีค่าไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ ค่าแอคติวิตีสุทธิสูงสุดต่อ 109 เซลล์ของเอนไซม์ที่แยกได้จาก พลาสโมเดียม ชาบอดี AS (Pr1) มีค่าสูงกว่าที่วัดได้ในเชื้อโคลน AS เล็กน้อย นอกจากนี้ยังพบว่าไพริเมธามีนความเข้มข้นสูงถึง 0.25 มิลลิโมลาร์ (หนึ่งในสี่ของความเข้มข้นของ DHPP ) จะไม่มีผลกระทบต่อแอคติวิตีของเอนไซม์ ไดไฮโดรพเทอโรเอต ซินเตส จากเชื้อทั้งสองโคลน ผลการวิจัยให้ข้อมูลสนับสนุนสมมติฐานการออกฤทธิ์ไพริเมธามีนในการยับยั้งการเจริญของพลาสโมเดียมว่า ไพริเมธามีนมีผลกระทบโดยตรงต่อเอนไซม์ไดไฮโดรโฟเลต รีดักเตส