สมบัติทางกายภาพและทางชีวเคมีของไคทิเนสบริสุทธิ์บางส่วนจาก Bacillus cereus

Abstract

Bacillus cereus สามารถผลิตไคทิเนสและขับออกสู่อาหารเลี้ยงเชื้อที่มีคอลลอยคัลไคทินเป็นองค์ประกอบ และการเพิ่มอะซิเทตที่ความเข้มขัน 10 มิลลิโมลาร์ทำให้ B. cereus มีไคทิเนสแอคติวิตีสูงขึ้น เมื่อนำไคทิเนสจากนํ้าเลี้ยงเชื้อมาทำให้บริสุทธิ์ยิ่งขึ้นโดยการกรองแบบอุลทราฟิลเตรชัน ผ่านคอลัมน์ดีอีเออีเซลลูโลส คอลัมน์รีเจนเนอเรทเทดไคทิน และคอลัมน์เซฟาเด็กช์จี-200 จะได้เอนไซม์ที่มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 24 เท่า ผลผลิต 11 เปอร์เซ็นต์ และมีแอคติวิตีจำเพาะ 0.62 ยูนิต/มิลลิกรัมโปรตีนเมื่อทำการตรวจสอบความบริสุทธิ์และแอคติวิตีฃองเอนไซม์ด้วยพอลิอะคริลาไมด์เจลอิเลคโทรฟอรีซีสแบบไม่เสียสภาพ พบว่าเอนไซม์ที่ได้จากคอลัมน์รีเจนเนอเรทเทดไคทิน ให้แอคติวิตีของไคทิเนส 2 แถบ การศึกษาขนาดโมเลกุลด้วยเอสดีเอล-พอลิอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโทรฟอรีซิสแบบเสียสภาพพบว่าในสารละลายเอนไซม์อย่างหยาบมีไคทิเนสอย่างน้อย 6 ชนิด มีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 89, 50.5, 43.4, 36, 31.4 และ 17.6 กิโลดาลตัน เมื่อนำสารละลายเอนไซม์ไปผ่านขั้นตอนการทำบริสุทธิ์ด้วยรีเจนเนอเรทเทดไคทิน พบแถบแอคติวดีเหลือเพียง 3 แถบกว้างซึ่งมีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 33.3, 20.3,16.2 กิโลดาลตัน ส่วนเอนไซม์ที่ผ่านคอลัมน์เซฟาเด็กซ์จี-200 ไม่มีข้อมูลเนื่องจากไม่สามารถย้อมแอคติวิตีของไคทิเนสได้ แต่การคำนวณน้ำหนักโมเลกุลจากแอคติวิตีพีคของขั้นตอนการทำเซฟาเด็กซ์จี-200 พบว่ามีน้ำหนักโมเลกุลของเอนไซม์ประมาณ 25 กิโลดาลตัน เมื่อนำสารละลายเอนไซม์ที่ผ่านเซฟาเด็กจี - 200 ไปศึกษาพบว่าความเป็นกรด-ด่างและอุณหภูมิที่เหมาะสมของเอนไซม์ในการย่อยคอลลอยคัลไคทิน คือ 6.0 และ 60 องศาเซลเซียส ตามลำคับ ความเสถียรของเอนไซม์อยู่ในช่วง pH 4-12 และในช่วงอุณหภูมิ 25-65 องศาเซลเซียส ตามลำดับ เอนไซม์สามารถไฮโดรไลซ์คอลลอยคัลไคทิน ไกลคอลไคทิน ริเจนเนอเรทเทดไคทิน และไคทินบริสุทธิ์ได้ดีตามลำดับจากมากไปน้อย (100, 50, 24 และ 12 เปอร์เซ็นต์ตามลำดับ) และไม่ย่อยไคโตแซน ไกลคอลไคโตแซน และไคทินผงไม่บริสุทธิ์ จากการตรวจสอบแอคติวิตีของเอนไซม์ด้วยสับสเตรทที่มีสีพบเป็นแบบไคโทไบโอซิเดล และเอ็นโดไคทิเนส ในอัตราส่วน 1.07:1.00 และไม่มีแอคติวิตีของเอ็น-อะซิทิลกลูโคซามินิเดล ผลของไอออนที่มีต่อแอคติวิตีของเอนไซม์พบว่าที่ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ของ CuSO4, MnCI2, HgCI2 และ ZnS04 ยับยั้งแอคติวิตีของเอนไซม์อย่างสมบูรณ์ CaCI2 และ FeCI2 ยับยั้งแอคติวิตีของเอนไซม์ได้เกือบสมบูรณ์ (98-99 เปอร์เซ็นต์) ส่วน MgCI2 ยับยั้งแอคติวิตีของเอนไซม์ได้เล็กน้อย (6 เปอร์เซ็นต์)