การเชื่อมกันของพีเอ็นเอที่มีคอนฟอร์เมชันจำกัดในภาวะสารละลาย

Abstract

เพปไทด์นิวคลีอิกแอซิด (พีเอ็นเอ) เป็นสารสังเคราะห์เลียนแบบโอลิโกนิวคลีโอไทด์ธรรมชาติ ซึ่งประกอบด้วยแกนหลักเป็นเพปไทด์ที่ปราศจากประจุ ซึ่งส่งผลต่อการเพิ่มขึ้นของความแข็งแรงของการจับยึดและความจำเพาะต่อการเข้าคู่เบสของพีเอ็นเอ-ดีเอ็นเอที่สูงกว่าดีเอ็นเอ-ดีเอ็นเอ ด้วยคุณสมบัติที่ดีเยี่ยม ของพีเอ็นเอ มันจึงสามารถนำไปประยุกต์ใช้ในด้านต่างๆ ได้อย่างหลากหลาย โดยทั่วไป การสังเคราะห์พีเอ็น เอนิยมกระทำโดยการสังเคราะห์เพปไทด์บนวัฏภาคของแข็ง ซึ่งจะให้ประสิทธิภาพสูงกว่าในวัฏภาค สารละลาย อย่างไรก็ตาม ประสิทธิภาพในการสังเคราะห์ลดลงอย่างมากเมื่อสังเคราะห์พีเอ็นเอโอลิโกเมอร์ที่ มีความยาวมากๆ (มากกว่า 10-15 เบส) ในงานวิจัยนี้ผู้วิจัยสนใจที่จะพัฒนาวิธีการสังเคราะห์พีเอ็นเอที่มี ลำดับเบสยาวขึ้น โดยอาศัยกระบวนการเชื่อมต่อเปรียบเทียบกัน 3 วิธี ดังนี้ 1) การเชื่อมกันด้วยการทำปฏิกิริยาคลิก (Click reaction) ระหว่างหมู่ฟังก์ชันเอไซด์ กับแอลไคน์ 2) การเชื่อมกันด้วยปฏิกิริยาการ แลกเปลี่ยนของไทออล (Thiol-exchange reaction) ของหมู่ฟังก์ชันไทออลกับพิริดิลไดซัลไฟด์ และ 3) การเชื่อมกันด้วยการทำปฏิกิริยาไมเคิลแอดดิชัน (Michael addition reaction) ของหมู่ฟังก์ชันไทออลกับ มาลิอิไมด์ โดยพีเอ็นเอที่ใช้ในงานวิจัยนี้คือพีเอ็นเอชนิดที่มีคอนฟอร์เมชันจำกัดที่เรียกว่าเอซีพีซีพีเอ็นเอซึ่ง แสดงสมบัติการจับยึดกับดีเอ็นเอที่แข็งแรงและจำเพาะเจาะจงกว่าพีเอ็นเอปกติปฏิกิริยาเชื่อมต่อจะกระทำกับไดเมอร์ของเอซีพีซีพีเอ็นเอที่มีลำดับเบสเป็น TT และผ่านการดัดแปรที่เหมาะสมเป็นตัวอย่างทดสอบ โดยติดตามการเกิดปฏิกิริยาการดัดแปรและการเชื่อมต่อของพีเอ็นเอด้วยเทคนิคมัลดิทอฟ แมสสเปกโตรเมท รี พบว่าการเชื่อมกันของพีเอ็นเอด้วยปฏิกิริยาไมเคิลแอดดิชันของเอซีพีซีพีเอ็นเอที่ถูกดัดแปรด้วยหมู่ไทออล และเอซีพีซีพีเอ็นเอที่ถูกดัดแปรด้วยหมู่มาลิอิไมด์ให้ผลดีที่สุด โดยการเติมหมู่ไทออลเข้าไปที่เอซีพีซีพีเอ็นเอ ในรูปแบบที่ถูกปกป้องด้วยหมู่อะเซติลโดยอาศัยการสังเคราะห์เพปไทด์ตามปกติ จากนั้นจึงกำจัดหมู่ปกป้อง ออกด้วยไฮดราซีน โดยสามารถกำจัดไดซัลไฟด์ที่เป็นผลิตภัณฑ์ข้างเคียงและเปลี่ยนให้เป็นไทออลโมโนเมอร์ โดยการทำปฏิกิริยากับทริส(คาร์บอกซีเอทิล)ฟอสฟีน (TCEP) ก่อนนำไปเชื่อมต่อกับเอซีพีซีพีเอ็นเอที่ถูกดัดแปรด้วยหมู่มาลิอิไมด์ การศึกษาโดยมัลดิ-ทอฟแสดงให้เห็นประสิทธิภาพการเชื่อมต่อที่ดีดังจะเห็นได้จากการเกิดผลิตภัณฑ์จากการเชื่อมต่อที่ต้องการเป็นส่วนใหญ่ โดยมีผลิตภัณฑ์ข้างเคียงอื่นเกิดน้อยมาก