การคัดเลือกแบคทีเรียที่ผลิตแอล-อะลานีนดีไฮโดรจิเนส ที่ต้องการไพริดีนนิวคลีโอไทด์เป็นโคเอนไซม์ และการทำเอนไซม์ให้บริสุทธิ์

Abstract

การคัดเลือกแอล-อะลานีนดีไฮโดรจิเนสที่ต้องการไพริดีนนิวคลีโอไทด์เป็นโคเอนไซม์จากแบคทีเรียในดิน พบว่าไอโซเลทที่มีค่าแอคติวิตีของเอนไซม์ชนิดนี้สูงสุด คือ Aeromonas hydrophila ภาวะที่เหมาะสมในการผลิตแอล-อะลานีนดีไฮโดรจิเนสเมื่อเลี้ยงแบคทีเรียในอาหารอุดม peptone 1 เปอร์เซนต์ในระดับขวดเขย่า คือ pH 4.5 ที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส เป็นเวลาประมาณ 24 ชั่วโมงหลังจากทำเอนไซม์ให้บริสุทธิ์โดยตกตะกอนด้วยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตและแยกโดยโครมาโตกราฟฟีคอลัมน์ดีอีเออีเซลลูโลส คอลัมน์ไฮดรอกซีอะพาไทต์ คอลัมน์บลูเซฟาโรสและเซฟาเด็กซ์จี-200 เอนไซม์มีความบริสุทธิ์ขึ้น 100 เท่า น้ำหนักโมเลกุลของแอล-อะลานีนดีไฮโดรจิเนสซึ่งวิเคราะห์โดยใช้เซฟาเด็กซ์จี -200 เท่ากับ 230,000 ดาลตัน การวิเคราะห์ด้วยเอสดีเอส-พอลิอะคริลาไมด์เจลอิเลคโทรโฟริซิสแสดงว่าเอนไซม์แอล-อะลานีนดีไฮโดรจิเนสประกอบด้วย 6 หน่วยย่อยที่มีน้ำหนักโมเลกุลเท่ากันคือ 40,000 ดาลตัน เอนไซม์นี้มีความจำเพาะต่อสับสเตรทสูงมากโดยเฉพาะปฏิกิริยา oxidative deamination และมีความจำเพาะต่อ NAD+ สูงเช่นกัน นอกจากนี้พบว่าหมู่ซัลไฟดิลน่าจะมีผลต่อการเกิดปฏิกิริยา อุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับเร่งปฏิกิริยา reductive amination และ oxidative deamination คือ 45 และ 55 องศาเซลเซียสตามลำดับ และเอนไซม์มีความเสถียรที่อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียสนาน 16 ชั่วโมง ค่า pH ที่เหมาะสมในการเร่งปฏิกิริยา reductive amination และ oxidative deamination คือ pH 8.0 และ 10.5 ตามลำดับ จากการศึกษาทางจลนพลศาสตร์ของเอนไซม์ตลอดจนการยับยั้งโดยผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยา (product inhibition) แสดงให้เห็นถึงกลไกของปฏิกิริยาเป็นแบบ sequential ordered binary-ternary mechanism ซึ่งจะมีลำดับการจับของสับสเตรทคือ NAD+ จับกับเอนไซม์ก่อนตามด้วยแอล-อะลานีนแล้วปล่อยไพรูเวทออกมาตามด้วยแอมโมเนียและNADH ตามลำดับ ค่า Km ของ NAD+ แอล-อะลานีน ไพรูเวท แอมโมเนีย และ NADH เท่ากับ 0.17, 20, 1.33, 77 และ 0.25 มิลลิโมลาร์ตามลำดับ นอกจากนี้พบว่าลำดับของกรดอะมิโนทางด้านปลาย N คือ MIIGVPTEIANHELRVGMSV