Please use this identifier to cite or link to this item:
https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/72318
| Title: | การกลายพันธุ์เชื้อ Bacillus sp. a11 เพื่อเพิ่มแอคติวิตี ของไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคลซิลทรานสเฟอเรส |
| Other Titles: | Mutation of bacillus sp. a11 for increasing cyclodextrin glycosyltransferase activity |
| Authors: | จิราภรณ์ จันทรมา |
| Other author: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. บัณฑิตวิทยาลัย |
| Subjects: | การกลายพันธุ์พืช จุลินทรีย์ Plant mutation Microorganisms |
| Issue Date: | 2540 |
| Publisher: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย |
| Abstract: | ในการกลายพันธุ์เชื้อ Bacillus sp. A11 เพื่อเพิ่มแอคติวิตีของไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคลซิลทรานสเฟอเรส (CGTase) โดยใช้แสง UV และสารเคมี NTG หาสภาวะที่เหมาะสม คือช่วงเวลาการฉายแสงได้ 80 วินาที และความเข้มข้น NTG ในช่วง 5-100 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ทำการคัดเลือกโคโลนีขั้นปฐมภูมิ โดยวิธีวัดค่า clear zone บนอาหารแข็งที่มีแป้งเป็นส่วนประกอบ คัดเลือกขั้นทุติยภูมิ โดยใช้วิธีวัด CD-TCE activity และ Dextrinizing activity ผลการทดลองพบว่าหลังการกลายพันธุ์ 4 ครั้ง ได้สายพันธุ์กลายที่ดีที่สุดคือ UNUN-97 มี Dextrinizing activity และ CD-TCE activity สูงกว่าสายพันธุ์ตั้งต้น 2.2 เท่า และ 22 เท่า ตามลำดับ เมื่อเทียบลักษณะรูปร่างโคโลนีของสายพันธุ์กลายกับสายพันธุ์ตั้งต้น เมื่อสังเกตด้วยตาเปล่าพบว่า ไม่มีความแตกต่างกันทั้งขนาดรูปร่างลักษณะ และสี แต่เมื่อส่องดูด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน Scanning Electron Microscope และกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน Transmission Electron Microscope ลักษณะเซลล์สายพันธุ์กลายต่างจากสายพันธุ์ตั้งต้นคือ ความยาวต่อความกว้างของแท่งเซลล์ต่ำกว่าสายพันธุ์ตั้งต้น เมื่อเก็บเชื้อทั้ง 2 สายพันธุ์ไว้ที่ -20 ๐ซ เป็นเวลา 60 วัน เพื่อตรวจสอบความคงทนของสายพันธุ์กลายและสายพันธุ์ตั้งต้นในการรักษาประสิทธิภาพการผลิต CGTase พบว่า สายพันธุ์กลาย UNUN-97 มีความคงทนสูงกว่าสายพันธุ์ตั้งต้น ในการเปรียบเทียบสมบัติของ CGTase ที่สายพันธุ์กลายผลิตได้เทียบกับสายพันธุ์ตั้งต้น พบว่าสภาวะความเป็นกรด-ด่าง ที่เหมาะสมต่อการเร่งปฏิกิริยา Dextrinizing activity ของ CGTase ของทั้ง 2 สายพันธุ์ อยู่ในช่วง pH 6-7 และอุณหภูมิที่เหมาะสมต่อการเร่งปฏิกิริยาคือ ที่อุณหภูมิ 60-65 ๐ซ รูปแบบโปรตีน CGTase ที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์บางส่วนของทั้งสายพันธุ์ตั้งต้นและสายพันธุ์กลาย จากการทำโพลีอะคริลาไมด์เจลอิเลคโทรโฟรีซิส แบบไม่เสียสภาพ ปรากฏแถบโปรตีน 1 แถบ และโพลีอะคริลาไมด์เจลอิเลคโทรโพรีซิสแบบเอสดีเอส ได้โปรตีน 2 แถบ ซึ่งเมื่อเปรียบเทียบกับโปรตีนมาตรฐาน น้ำหนักโมเลกุลของแถบโปรตีนมีค่า 70,000 และ 45,000 ดาลตัน เมื่อเปรียบเทียบ CGTase ในด้านความจำเพาะต่อแอนติบอดี พบว่าสามารถทำปฏิกิริยากับแอนติบอดีต่อ CGTase ได้เส้นตะกอน ซึ่งมีค่าไตเตอร์เท่ากับ 1:25 ทั้งสายพันธุ์ตั้งต้นและสายพันธุ์กลาย ในการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ไซโคลเดกซ์ทรินที่เกิดจากการย่อยแป้งของ CGTase ของสายพันธุ์ตั้งต้นและสายพันธุ์กลาย ด้วย HPLC พบว่า ทั้ง 2 สายพันธุ์ให้ผลิตภัณฑ์หลักเป็น β-CD |
| Other Abstract: | Mutation of Bacillus sp. A11 to increase CGTase activity was performed by UV exposure and NTG treatment. The optimum conditions of exposure time was 80 seconds and NTG concentration was between 5-100 µg/ml. Primary screening of colonies was the measurement of clear zone on starch containing agar. Secondary screening was by CD-TCE activity assay and Dextrinizing activity assay. After 4 times mutation using alternate treatment between UV and NTG treatment, the best mutant was the strain UNUN-97 which showed Dextrinizing activity and CD-TCE activity 2.2 and 22 times higher than wild type, respectively. When comparing cell morphology, Bacillus sp. A11 and strain UNUN-97 were not looking different by size, shape, and color when grown on agar medium. But when observed under Scanning Electron Microscope and Transmission Electron Microscope, the length to width ratio of cells of strain UNUN-97 was lower than that of wild type. When both strains were stored at -20 ๐C for 60 days, strain UNUN-97 was better than the wild type in the ability to keep level of CGTase production. Properties of CGTase produced by wild type and strain UNUN-97 were compared. Optimum pH for Dextrinizing reaction was pH 6-7 and temperature was 60-65 ๐C for both strains. The prepared partially purified CGTases when analyzed by PAGE were not different. They demonstrated a single band on non denaturing-gel and two bands on SDS-gel. The molecular weight of the protein bands were estimated to be 70,000 (CGTase band) and 45,000 dalton (other protein). Comparison of specificity to antibody against CGTases of both strains resulted in the same antibody titer of 1:25. HPLC analysis of reaction products catalyzed by CGTases of both strains indicated the same major β-CD product. |
| Description: | วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2540 |
| Degree Name: | วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต |
| Degree Level: | ปริญญาโท |
| Degree Discipline: | เทคโนโลยีชีวภาพ |
| URI: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/72318 |
| ISBN: | 9746383957 |
| Type: | Thesis |
| Appears in Collections: | Grad - Theses |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| Jiraporn_ju_front_p.pdf | หน้าปก สารบัญ และ บทคัดย่อ | 961.66 kB | Adobe PDF | View/Open |
| Jiraporn_ju_ch1_p.pdf | บทที่ 1 | 992.93 kB | Adobe PDF | View/Open |
| Jiraporn_ju_ch2_p.pdf | บทที่ 2 | 1.17 MB | Adobe PDF | View/Open |
| Jiraporn_ju_ch3_p.pdf | บทที่ 3 | 2.59 MB | Adobe PDF | View/Open |
| Jiraporn_ju_ch4_p.pdf | บทที่ 4 | 1.2 MB | Adobe PDF | View/Open |
| Jiraporn_ju_back_p.pdf | บรรณานุกรมและภาคผนวก | 599.42 kB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.