การทำให้บริสุทธิ์บางส่วนและลักษณะสมบัติของสารต้านจุลชีพจาก Bacillus sp. S11

Abstract

Bacillus sp. S11 ที่ใช้เป็นโพรไบโอติกในการเพาะเลี้ยงกุ้งกุลาดำสามารถสร้างสารต้านจุลชีพได้ในระยะ log phase ของการเจริญ ภาวะการเลี้ยงที่เหมาะสมต่อการสร้างสารนี้คือ การใช้อาหารเลี้ยงเชื้อที่ประกอบด้วย สารสกัดจากยีสต์ 2% (น้ำหนัก/ปริมาตร) ไดโพรแทสเซียม ฟอสเฟต 0.25% (น้ำหนัก/ปริมาตร) พีเอชของอาหารเลี้ยงเชื้อเริ่มต้นที่ 7.0 ใช้ปริมาณหัวเชื้อตั้งต้นที่ 2.0% (ปริมาตร/ปริมาตร) อุณหภูมิในการเพาะเลี้ยง 40 องศาเซลเซียส บนเครื่องเขย่า 200 รอบต่อนาที สารนี้สามารถทนความร้อนที่อุณหภูมมิ 70 และ 80 องศาเซลเซียสได้ 15 นาที และถูกทำลายหมดภายในเวลา 60 นาที เมื่อเก็บไว้ที่ 100 องศาเซลเซียสแอคติวิตีของสารหมดไปภายใน 10 นาที และตรวจไม่พบแอคติวิดีของสารนี้หลังผ่านการ นึ่งฆ่าเชื้อ 121 องสาเซลเซียส 20 นาที สารนี้มีแอคติวิดีได้ในช่วงพีเอชตั้งแต่ 4-10 และปริมารโซเดียมคลอไรดื 0-5% (น้ำหนัก/ปริมาตร) ไม่มีผลต่อแคติวิดี ภายหลังจากการบำบัดด้วยเอนไซม์ protease, a-amylase และ lipase พบว่า protease ทำให้แอคติวิดีของสารนี้ลดลงในขณะที่เอนไซม์อีกสองชนิดไม่มีผลต่อแอคติวิดีของสารต้านจุลชีพนี้ ตัวทำละลายได้แก่ อะซีโตน อะซีโตไนไทรล์ เอธานอลและเมธานอล ไม่สามารถลดแอคติวิตีของสารต้านจุลชีพนี้ได้ ในขณะที่ คลอโรฟอร์ม ไดเอธิลอีเธอร์และโทลูอีนทำให้แอคติวิตีในชั้นของน้ำหมักลดลงได้ เมื่อนำสารต้านจุลชีพที่ผ่านการตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตในช่วง 0-30% มาทดสอบฤทธิ์ในการฆ่าแบคทีเรียกับเชื้อทดสอบสองชนิดคือ B.cereus ATCC 11778 และ V. harveyi 639 พบว่าต้องใช้ความเข้มข้นสุดท้าย 4.10 AU/ml ในการฆ่าแบคทีเรีย B. cereus ATCC 11778 หมดภายใน 5 ชั่วโมง และการใช้สารนี้ที่ความเข้มข้นสุดท้ายน้อยกว่า 204.8 AU/ml ไม่สามารถฆ่า V.harveyi 639 ได้หมดภายในเวลา 5 ชั่วโมง สารต้านจุลชีพที่ได้ถูกทำให้บริสุทธืตามขั้นตอนดังนี้ ตกตะกอนด้วย 0-30 % แอมโมเนียมซัลเฟต ผ่านคอลัมน์ Sephadex G-50 และผ่าน DEAE-Sephadex A-25 ให้ค่า specific activity เพิ่มขึ้นจากที่มีในน้ำหมัก 28.57 AU/mg protein เป็น 1256.44, 2133.33 และ 3200 AU/mg protein ตามลำดับ เมื่อวิเคราะห์ด้วย SDS-PAGE และจากผลการติดสี Sudan Black B พบว่าสารนี้มีมวลโมเลกุลประมาณ 3.5 kDa และมี lipid เป็นองค์ประกอบ