การทำให้บริสุทธิ์และการศึกษาสมบัติของเอนไซม์นิวทรัลโปรตีเอส จาก Bacillus subtilis TISTR 25

Abstract

ทำการแยกเอนไซม์นิวทรัลโปรตีเอสจาก Bacillus subtilis TISTR 25 ให้บริสุทธิ์โดยการตกตะกอน ด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัว 40 - 70% แล้วผ่านคอลัมน์โครมาโตรกราฟฟี 2 ชนิด คือ ซีเอ็ม เซลลูโลส และ เซฟา เด็กซ์ จี 75 สามารถแยกเอนไซม์นิวทรัลโปรตีเอสให้มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 4.6 เท่า ทดสอบความบริสุทธิ์โดยเทคนิค โพลีอะไครลาไมด์ เจล อิเลคโตรโฟรีซิสได้แถบโปรตีนเพียงแถบเดียว นำไปหาขนาดและหน่วยย่อยของเอนไซม์ โดยวิธี เอสดีเอส โพลีอะไครลาไมด์ เจล อิเลคโตรโฟรีซีส พบว่าเอนไซม์ เป็นโพลีเปปไทด์สายเดี่ยว มีขนาดโมเลกุล 37,000 ดาลตัน สภาวะที่เหมาะสมในการเร่งปฏิกิริยาการย่อยสลายเคซีนดีที่สุดที่ pH.7 และอุณหภูมิ 50 °ซ. เอนไซม์ ที่ทำให้บริสุทธิ์นี้ไม่สามารถย่อยสลายพันธะเอสเทอร์ได้ และจากการศึกษาค่าคงที่ทางจลศาสตร์ของเอนไซม์ (Kₘ)ต่อลับสเตรท เคซีน ฮีโมโกลบิน และ เอโซคอล มีค่าเท่ากับ 0.04, 0.06 มิลลิโมล/ลิตร และ 10 มก. / มล. ตามลำดับ ซึ่งทำการทดลองเปรียบเทียบกับเอนไซม์ Thermolysin จาก B. thermoproteolyticus พบว่า Thermolysin มีความจำเพาะต่อลับสเตรททั้งสามชนิดดีกว่าเอนไซม์ที่ทำให้บริสุทธิ์จาก TISTR 25 แต่เอนไซม์จาก TISTR 25 มีความเร็วสูงสุด (Vₘₐₓ) ในการเร่งปฏิกิริยาลับสเตรททั้งสามชนิดนี้ดีกว่า Thermolysin และเมื่อศึกษาความจำเพาะต่อลับสเตรทที่เป็นเปปไทด์สังเคราะห์ พบว่านิวทรัลโปรตีเอสจาก TISTR 25 สามารถย่อยลับสเตรทที่มีขนาดตั้งแต่ tripeptide ขึ้นไป และมีความจำเพาะต่อปลายด้าน N ของกรดอะมิโนะขนาดใหญ่ เช่น ลิวซีน, ฟินิลอะลานีน หรือ อาร์จินิน เช่นเดียวกับเอนไซม์ Thermolysin เอนไซม์นิวทรัลโปรตีเอสจาก B. subtilis TISTR 25 มีปริมาณอะตอมสังกะสีในโมเลกุลเท่ากับ 1.5 อะตอม / โมเลกุล เอนไซม์ถูกยับยั้งปฏิกิริยาได้ด้วยสารคีเลตติ้ง EDTA และ Phenanthroline จากการทดลองใช้ EDTA ที่ความเข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์ สามารถยับยั้งปฏิกิริยาประมาณ 80% และแอดติวิดีจะ กลับคืนได้ถ้ามีการเติมไดวาเลนท์ที่เหมาะสม ซึ่งจากการทดลองพบว่าเมื่อมีการเติม 1 มิลลิโมลาร์ของ Zn⁺⁺ , Mn⁺⁺ และ Co⁺⁺ แอคติวิดีจะสามารถกลับคืนมาได้ดีกว่าเมื่อเติม 1 มิลลิโมลาร์ของ Ca⁺⁺ , Fe⁺⁺ และ Mg⁺⁺