Please use this identifier to cite or link to this item:
https://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/74068
| Title: | การโคลนยีนไซโคลเดกซ์ทริน กลูคาโนทรานสเฟอเรสจาก Bacillus A11ใน Escherichia coli |
| Other Titles: | Molecular cloning of cyclodextrin glucanotransferase gene from Bacillus A11 in Escherichia coli |
| Authors: | สุรศักดิ์ ศิริพรอดุลศิลป์ |
| Advisors: | วิเชียร ริมพณิชยกิจ พีรดา มงคลกุล |
| Other author: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. บัณฑิตวิทยาลัย |
| Subjects: | ไซโคลเดกซตริน การโคลนยีน Cyclodextrins Molecular cloning |
| Issue Date: | 2536 |
| Publisher: | จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย |
| Abstract: | ได้ทำการโคลนยีนไซโคลเดกซ์ทริน กลูคาโนทรานสเฟอเรส (CGTase gene) จาก Bacillus A₁₁ เข้าไปใน Escherichia coli โดยใช้พลาสมิด pBR322, pUC18 และ pSE411 เป็นดีเอ็นเอพาหะtialตามลำดับ นำดีเอ็นเอของโครโมโซมจาก Bacillus A₁₁ ที่ย่อยด้วยเรสติกชั่นเอนไซม์ Sau3AI แบบไม่สมบูรณ์ (partial digestion) มาเชื่อมเข้ากับตำแหน่ง BamHI บนพลาสมิด pBR322 แล้วเคลื่อนย้ายรีคอมบิแนนท์พลาสมิดที่สร้างขึ้นใหม่เข้าสู่เซลล์เจ้าเรือน E. coli strain HB101 ทำการคัดเลือกทรานสฟอร์แมนท์ที่สามารถผลิตเอนไซม์ CGTase โดยการวัดแอคติวิตีของเอนไซม์ ซึ่งประกอบด้วยการทำ iodine-test, Phenol red inclusion complex test (PICT), cyclodextrin trichloroethylene assay (CD-TCE assay) และวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ CDs ด้วย HPLC รีคอมบิแนนท์พลาสมิดที่มี CGTase gene ให้ชื่อว่า pSVl มีขนาดของขึ้นดีเอ็นเอจาก Bacillus A₁₁ ประมาณ 20 - 22 kb เนื่องจาก pSVI มีขนาดใหญ่และไม่เสถียร จึงทำการโคลนยีนต่อโดยย่อยรีคอมบิแนนท์พลาสมิด pSVl ด้วยเรสติกชั่นเอนโซม์ Sau3AI แบบไม่สมบูรณ์ แล้วเลือกขึ้นดีเอ็นเอที่มีขนาดประมาณ 2 – 6 kb และเชื่อมขึ้นดีเอ็นเอนี้ เข้าไปในตำแหน่ง BamHI ของพลาสมิด pUC18 เคลื่อนย้ายรีคอมบิแนนท์ดีเอ็นเอเข้าสู่เซลล์เจ้าเรือน E. coli strain JM101 พบทรานสฟอร์แมนที่แสดง amylolytic activity 3 ทรานสฟอร์แมนท์ แต่แสดง CGTase activity เพียง 2 ทรานสฟอร์แมนท์ และสามารถกระตุ้นการสร้างเอนไซม์ CGTase ได้ด้วย IPTG ให้ขี่อริคอมบิแนนท์พลาสมิดใหม่นี้ว่า pSV2 และ pSV3 ซึ่งมีขนาดขึ้นดีเอ็นเอจาก Bacillus A ₁₁ ประมาณ 6.8 และ 5.2 kb ตามลำดับ เนื่องจากการนำรีคอมบิแนนท์พลาสมิด pSV3 มาศึกษา restriction map ทำได้ยากจึงได้โคลนยีนอีกครั้งโดยย้าย inserted DNA fragment จากรีคอมบิแนนท์พลาสมิด pSV3 ไปตัดต่อเข้ากับพลาสมิด pSE411 โดยใช้เรสติกชั่นเอนไซม์ PstI และ KpnI แล้วทรานสฟอร์มเข้า E. coli strain HB101 ให้ชื่อทรานสฟอร์มแนท์และรีคอมบิแนนท์พลาสมิดที่สร้างขึ้นใหม่ว่า SV5 และ pSV5 ตามลำดับ เมื่อศึกษา restriction map ของรีคอมบิแนนท์พลาสสมิด pSV5 พบว่า CGTase gene Bacillus A₁₁ แตกต่างจาก CGTase gene จากสายพันธุ์อื่น ผลการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ CDs ด้วย PHLC พบว่าทรานสฟอร์แมนท์ SV5 ให้ผลิตภัณฑ์ Υ-CD ในสัดส่วนที่มากที่สุดตามด้วย β- และ α-CD สามารถตรวจพบแถบโปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุลใกล้เคียงและเท่ากับเอนไซม์ CGTase จากทรานสฟอร์แมนท์ SV5 ด้วยเอสดีเอส-โพลีอะไครลาไมด์เจลอิเลคโตรโฟรีซิส |
| Other Abstract: | The cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) gene from Bacillus A₁₁ has been cloned into Escherichia coli using plasmid vector pBR322, pUC18 and pSE411 respectively. Partially Sau3AI-digested chromosomal DNA from Bacillus A₁₁ was ligated to BamHI-cleaved pBR322 and transformed into E. coli strain HB101. CGTase producing transformats were screened and isolated by iodine test, phenol red inclusion complex test, trichloroethylene precipitation and HPLC analysis. The constructed plasmid, oSV1, was isolated and analysed. The cloned CGTase gene was found to be within an approximately 20 – 22 kb insert. Due to its large size and instability, pSVl was used for subcloning. It was partially digested with Sau3AI and DNA fragments of 2 to 6 kb were isolated and ligated to BamHI-cleaved pUC18. The ligation mixture was then transformed into E. coli strain JM101. Three halo-positive transformants were obtained but only 2 transformants showed CGTase activity which was inducible by IPTG. The plasmids obtained were designated as pSV2 and pSV3, and found to contain an approximately 6.8 and 5.2 kb DNA insert, respectively. For unknown reason, these plasmids were only partially digested with respectively endonuclease used, making it difficult to do restriction mapping. Therefore, the inserted DNA fragment from pSV3 was further subcloned as pstI-KpnI fragment into PstI-KpnI cleaved pSE4ll. The resulting plasmid and transformant were designated as pSV5 and SV5, respectively. The resulting plasmid and transformant were designted as pSV5 and SV5, respectively. Restriction mapping was performed on pSV5 and it was found that its pattern was different from those of other known CGTase gene. HPLC analysis of SV5-generated products indicated that the cloned CGTase produced Υ-CD > β-CD > α-CD By using SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, a protein band with MW equal to CGTase from Bacillus A₁₁ was detected as well as other presumably modified forms of the cloned CGTase. |
| Description: | วิทยานิพนธ์ (วท.ม.)--จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย, 2536 |
| Degree Name: | วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต |
| Degree Level: | ปริญญาโท |
| Degree Discipline: | ชีวเคมี |
| URI: | http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/74068 |
| Type: | Thesis |
| Appears in Collections: | Grad - Theses |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| Surasak_si_front_p.pdf | 1.2 MB | Adobe PDF | View/Open | |
| Surasak_si_ch1_p.pdf | 1.7 MB | Adobe PDF | View/Open | |
| Surasak_si_ch2_p.pdf | 1.56 MB | Adobe PDF | View/Open | |
| Surasak_si_ch3_p.pdf | 2.3 MB | Adobe PDF | View/Open | |
| Surasak_si_ch4_p.pdf | 1.16 MB | Adobe PDF | View/Open | |
| Surasak_si_back_p.pdf | 1.34 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.